豬瘟和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的PCR 診斷

蘇述色日

（四川省金陽縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 四川涼山610025）

豬 瘟（Classical swine fever，CSF）和豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的致病原分別為豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），兩種疾病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)都危害巨大。2018 年10 月某豬場(chǎng)發(fā)生了一起臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、全身出血及淋巴結(jié)腫大的疫病，通過臨床癥狀初步判斷為CSFV 或PRRSV 感染，為對(duì)病例進(jìn)行確診，筆者對(duì)其進(jìn)行了PCR 診斷。

1 材料與方法

1.1 臨床病料樣品的采集與處理

無菌采集病死豬的淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等病變組織，將其溶解于5 倍體積生理鹽水中，經(jīng)搗碎、碾磨、離心后，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照馬萍等[1]建立的CSFV 野毒株與疫苗株鑒別檢測(cè)方法設(shè)計(jì)合成1 對(duì)CSFV 野毒株特異性檢測(cè)引物（上游引物：5'-AGATTCCAGTGGTGAGAGGGGTA-3'； 下 游 引 物：5'-GCCGGCGCTAAATAAATAAAAAAT-3'），該引物可對(duì)CSFV野毒株擴(kuò)增出641bp的特異性片段，而對(duì)CSFV疫苗株無擴(kuò)增產(chǎn)物。參照曾繁文等[2]建立的PRRSV 不同毒株鑒別檢測(cè)方法設(shè)計(jì)合成1對(duì)特異性檢測(cè)引物（上游引物：5'-ATGAGTCTTCTACCCGAGG-3'；下游引物：5'-TCAGAGGTGACAGGATTG-3'），該引物可對(duì)PRRSV 的經(jīng)典毒株、高致病性毒株、疫苗株分別擴(kuò)增出1020bp、933bp、662bp 的特異性片段。

1.3 病毒基因組RNA 的提取與cDNA 的合成

利用病毒基因組RNA 提取試劑盒提取處理后的臨床病料樣品的基因組RNA，以RNA 為模板進(jìn)行cDNA 合成。cDNA 合成的反應(yīng)體系為：RNA 9μL、隨機(jī)引物1μL、5×Buffer 4μL、dNTP 4μL、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶1μL、RNA 酶抑制劑1μL。cDNA 合成的反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 50min，72℃ 10min，4℃終止反應(yīng)。

1.4 PCR 擴(kuò)增

以合成的cDNA 為模板，分別按照馬萍等[1]和曾繁文等[2]的PCR 擴(kuò)增方法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

如圖1 所示，臨床病料樣品經(jīng)CSFV 鑒別引物可擴(kuò)增出641bp 左右的特異性片段，大小與馬萍等[1]報(bào)道的CSFV 野毒株片段大小一致。如圖2 所示，臨床病料樣品經(jīng)PRRSV 鑒別引物可擴(kuò)增出933bp 左右的特異性片段，大小與曾繁文等[2]報(bào)道的PRRSV 高致病性毒株片段大小一致。上述結(jié)果表明臨床病料樣品經(jīng)PCR 檢測(cè)為CSFV 和PRRSV 陽性，該臨床病例發(fā)生了CSFV 和PRRSV 的混合感染。

圖1 CSFV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖2 PRRSV PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3 討論

CSF 和PRRS 都是豬易感的病毒性傳染病，兩種疾病混合感染大大提高了檢測(cè)難度，且臨床中兩種疾病引起的臨床表現(xiàn)極其相似，確診需借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，PCR 檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前疾病診斷最簡(jiǎn)單、最準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，在基層動(dòng)物疾病檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用。鑒于此，本研究采用PCR 方法對(duì)病例進(jìn)行了確診，為豬場(chǎng)后期及時(shí)采取預(yù)防和治療措施提供了保障。對(duì)于CSFV 和PRRSV 的防控都以疫苗免疫為主，在疫苗接種時(shí)要注意免疫途徑和免疫劑量，防止發(fā)生免疫失敗。同時(shí)加強(qiáng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出制，保持畜舍環(huán)境清新，定期通風(fēng)換氣，減少各種不利應(yīng)激因素影響，逐步達(dá)到防止疾病暴發(fā)和流行的目的。█