不同提取方法對五味子中木脂素成分提取率的影響

王佳燁，王曉麗，王新婷，單瑩瑩，李 賀，王春梅，孫紅霞，張成義，陳建光，孫靖輝

(北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

五味子是木蘭科植物五味子(Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.)的成熟干燥果實，具有極高的藥用價值和營養(yǎng)價值，是一種新型的既可藥用也可食用的功能性保健食品［1］.現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:中藥五味子中的化學(xué)成分有木脂素、揮發(fā)油、多糖等，其中木脂素類成分是其主要化學(xué)成分，具有肝保護、抗病毒、抗糖尿病、抗炎等功能［2-3］.有關(guān)五味子木脂素的提取方法有很多，包括超聲提取法、超臨界CO2流體萃取法、大孔吸附樹脂法、滲漉法、回流法、索氏提取法等，但不同提取方法之間所得到的五味子木脂素提取率略有差異［4-7］.現(xiàn)通過對超聲提取法、超臨界CO2流體萃取法和大孔吸附樹脂法進行比較，探討3種提取方法對五味子木脂素提取率的影響.

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(Waters，USA，型號e2695)配有UV檢測器(型號2998PDA)和色譜管理系統(tǒng)(版本號Millennium32);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司，型號R206B);超臨界CO2流體萃取儀(沈陽索福爾超臨界萃取設(shè)備有限公司，型號TC-SFE-36-10-320S);AS系列超聲波清洗機(天津奧特賽恩斯儀器有限公司，型號AS5150A).

1.2 材料和試劑

五味子(吉林省集安五味子種植基地，由北華大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室李鳳麗教授鑒定為木蘭科植物五味子的成熟干燥果實);分析級甲醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司);95%的乙醇(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司);大孔吸附樹脂(HPD100，上海紫一試劑廠);五味子木脂素類成分標(biāo)準(zhǔn)品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，五味子醇甲(批號:wkq182022702)、五味子酯甲(批號:wkq18052805)、五味子醇乙(批號:wkq18020804)、五味子乙素(批號:wkq18030811)、五味子丙素(批號:wkq18020607)、五味子甲素(批號:wkq18032609)、五味子酚(批號:151116))，以上標(biāo)準(zhǔn)品純度均超過98%;HPLC級甲醇、乙腈和乙酸乙酯(TEDIA，USA);實驗用水為娃哈哈純凈水.

2 方法與結(jié)果

2.1 五味子木脂素提取工藝

2.1.1 大孔吸附樹脂法

將五味子粉碎，過40目篩，然后稱取150 g五味子粉末，加入1 200 mL的95%乙醇回流1 h，連續(xù)提取兩次，合并兩次的濾液，進行抽濾旋蒸.加入蒸餾水使乙醇濃度達到70%，放置24 h后進行抽濾旋蒸，加蒸餾水將提取液定容至濃度為0.1 g/mL.用大孔吸附樹脂灌柱，柱高與直徑比為1∶6，加入提取液(若V柱=25 c m3，則V樣=70 mL).當(dāng)提取液快達到大孔樹脂以下時加入蒸餾水除去雜質(zhì)(若V柱=25 cm3，則V樣=50 m L)，之后用95%的乙醇洗脫(若V柱=25 cm3，則V樣=100 mL)，收集乙醇洗脫液進行旋蒸.最后將旋蒸液在水浴鍋上加熱至完全無醇味，冷凍干燥，最終得到五味子木脂素粉末5 g，提取率為3.33%.

2.1.2 超臨界 CO2流體萃取法

參考文獻［8-9］方法，將五味子粉碎，過40目篩，稱取150 g五味子粉末，加入萃取釜中，打開水浴，通入CO2，設(shè)定溫度為45℃，當(dāng)萃取裝置達到設(shè)定溫度時，打開壓縮泵調(diào)節(jié)壓力為30 MPa，將CO2流量調(diào)整為15 L/h，進行循環(huán)萃取120 min，待萃取完畢，關(guān)閉壓縮機、鋼瓶，放空CO2，將收集的液體進行冷凍干燥，得到五味子木脂素粉末 44.7 g，提取率為 29.8%.

2.1.3 超聲提取法

參考文獻［10-11］方法，將五味子粉碎，過40目篩，精密稱取150 g五味子粉末，置于具塞三角瓶中，加入90%乙醇3 000 mL，超聲提取30 min，將所得液體進行抽濾旋蒸，將旋蒸液在水浴鍋上加熱直至完全無醇味，冷凍干燥，最終得到五味子木脂素粉末21.42 g，提取率為14.28%.

2.2 色譜條件

五味子木脂素的測定參考苑廣信等［12］的HPLC方法，色譜柱:Venusil XBP C18(L)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);島津 GVP 保護柱(4.6 mm);流動相:甲醇(A)，水(B)，梯度條件見表 1;柱溫:27 ℃;流速:0.8 mL/min;檢測波長:230 nm;進樣量:10 μL.

表1HPLC梯度條件Tab.1 HPLC gradient conditions

2.3 溶液的制備

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取五味子醇甲、醇乙、酯甲、甲素和乙素各3 mg，五味子丙素和五味子酚各2 mg，用適量甲醇超聲溶解后定容于10 mL容量瓶中，得對照品儲備液，4℃儲存?zhèn)溆?，并作為混合?biāo)準(zhǔn)品.

2.3.2 五味子木脂素樣品溶液的制備

取3種提取方法所得到的提取物各50 mg，用適量甲醇溶解后定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的樣品儲備液，4℃儲存?zhèn)溆?，并作為待測樣品.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

將混合標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至不同倍數(shù)，得到8個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，濃度0.006～0.300mg/mL.分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液各1.0 mL，注入進樣品中，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積.以峰面積y為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo)，進行線性回歸，得各組分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見圖1和表2.結(jié)果顯示:各組分在實驗范圍內(nèi)線性關(guān)系良好［13-14］.

2.4.2 定量限(LOQ)和檢出限(LOD)

精密量取混合對照品溶液1 mL，采用倍比稀釋法制成系列質(zhì)量濃度的溶液，進行色譜分析，記錄色譜峰面積，以信噪比10∶1作為定量限，信噪比3∶1作為檢出限.測得五味子中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的定量限分別為 20，18，14，18.5，18，19.5，17 μg/mL;檢出限分別為 7，4，3.5，4.5，5，6.5，5.5 μg/mL.

2.4.3 精密度實驗

取0.1 mg/mL的混合對照品溶液，進行色譜分析，連續(xù)測定6次，每次進樣10 μL，記錄各色譜峰的相對峰面積，以峰面積計算RSD，RSD值為0.76%～1.89%，結(jié)果顯示:本方法測定的7種木脂素含量的精密度良好.

2.4.4 穩(wěn)定性考察

取 0.1 mg/mL 的混合對照品溶液，按 2.2 色譜條件，分別于 1，2，4，8，16，24 h 進樣測定，記錄各色譜峰的相對峰面積，以峰面積計算RSD，RSD值為0.84%～1.77%，結(jié)果顯示:本方法在24 h內(nèi)測定的7種木脂素含量的穩(wěn)定性良好.

2.4.5 重復(fù)性考察

取五味子原藥材，按2.1中的3種方法提取五味子木脂素，每種方法提取的五味子木脂素均平行制備5份濃度為5 mg/mL的供試品溶液，進行色譜分析，記錄各色譜峰的相對峰面積，以峰面積計算RSD，大孔吸附樹脂法提取得到的7種木脂素RSD值為0.79%～1.88%，超臨界CO2流體萃取法提取得到的7種木脂素的RSD值為0.66%～1.72%，超聲法提取得到的7種木脂素的RSD值為0.93%～1.91%，結(jié)果顯示:本方法測定樣品中7種木脂素含量的重復(fù)性良好.

2.4.6 回收率試驗

采用加樣回收法，精密稱取已知7種木脂素含量的藥材粉末9份，每份0.1 g，分別按高中低3個濃度精密加入7種木脂素對照品溶液，每一濃度平行加入3份，制備得樣品溶液，進行色譜分析，計算回收率.計算可知，在高中低3個加標(biāo)濃度下，7種木脂素的平均回收率為94.3%～103.7%，回收率RSD值為 0.8 6%～1.75%，結(jié)果顯示:本方法測定的7種木脂素含量的回收率良好.

2.5 樣品測定

分別取3種提取方法得到的木脂素待測樣品溶液各1 mL，通過0.45 μm的有機膜注入進樣瓶中，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜峰面積，根據(jù)回歸方程計算含量，求得樣品中7種木脂素的含量，每種提取方法均平行實驗3次.結(jié)果見圖2和表3.

3 討 論

就五味子木脂素的提取方法而言，傳統(tǒng)溶劑提取耗時，溶劑需求量大，工藝復(fù)雜，流程長，重現(xiàn)性差，提取效率低，存在許多固有的缺陷，且常用的有機溶劑大多有毒，易造成環(huán)境污染，危害實驗操作人員的健康［15］.現(xiàn)代科技的發(fā)展優(yōu)化了傳統(tǒng)的提取方法，使五味子木脂素的提取無論在實驗操作安全還是提取率上都大大增強.超臨界CO2萃取法臨界溫度低，提取原料中的有效成分能被很好保存，特別適合提取對熱敏感、易氧化分解的成分.另外，超臨界CO2萃取法提取能力強，產(chǎn)率高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)和生物工程等領(lǐng)域［15］，但相對其他兩種提取方法而言，此方法所采用的機器成本較高.超聲提取法具有提取時間短、提取溫度低、適應(yīng)性廣、操作簡單易行的特點，被廣泛應(yīng)用于中藥的提取分離中［16］.大孔吸附樹脂法具有吸附性能好、價格低廉、可再生利用、洗脫劑安全、操作簡單等優(yōu)點［17］.從提取率上看，用超臨界CO2流體萃取法提取的五味子木脂素提取率最高，總量可達 18.94 mg/g，提取物的提取率為 29.8%，遠高于另外兩種方法得到的提取物含量.超聲提取法所提取的五味子木脂素含量為17.96 mg/g，得到提取物的提取率為14.28%.大孔吸附樹脂提取五味子木脂素含量較少，為10.90 mg/g，得到提取物的提取率為3.33%，分析原因可能由于大孔吸附樹脂雖然能除去雜質(zhì)，但是也損耗了相當(dāng)一部分木脂素.通過對五味子木脂素提取方法的不斷探索和優(yōu)化，期望得到更高純度的五味子木脂素.本研究比較了3種方法提取五味子木脂素的優(yōu)缺點，為五味子木脂素提取方法的選擇提供了實驗依據(jù).