缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦梗死患者血清凋亡相關(guān)因子水平的影響

崔東岳，袁基科，岳萃濤

(中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽省立醫(yī)院急診科，安徽 合肥 233001)

急性腦梗死指的是腦血供突然中斷后引起的腦卒中壞死[1]。多由供應(yīng)腦部血液動(dòng)脈出現(xiàn)粥樣硬化、血栓形成，管腔狹窄甚至閉塞，使局部出現(xiàn)急性腦供血不足引起。發(fā)病機(jī)制與血管內(nèi)皮受損、微血管基底膜破壞等密切相關(guān)[2，3]，故臨床治療以促進(jìn)側(cè)支循環(huán)形成、提高新生血管床密度、促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)為主要目的。缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning，IP)[4]是通過給予一次或多次短暫、非致死性缺血刺激后，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使患者對(duì)更嚴(yán)重甚至致死性腦缺血損傷獲得耐受性。大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，缺血預(yù)適應(yīng)可顯著減輕再次缺血帶來的腦損傷，可使神經(jīng)元凋亡減少，缺血灶縮小，功能障礙改善[5，6]，但具體的作用機(jī)制尚未完全闡明?；诖?，本研究通過觀察缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)腦梗死患者治療效果、神經(jīng)功能的影響，檢測血清凋亡相關(guān)因子改善情況，初步探討血清凋亡因子在腦梗死中的作用，總結(jié)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年1月至2018年5月我院神經(jīng)內(nèi)科住院部收治的84例急性腦梗死患者，入院時(shí)均經(jīng)影像學(xué)檢查證實(shí)為急性腦梗死。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病，發(fā)病時(shí)間72 h內(nèi)；②臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室輔助檢查確診為急性腦梗死；③入院時(shí)美國國立衛(wèi)生院神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NIHSS)評(píng)分4～20分；④患者自愿參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①頭顱CT檢查提示存在顱內(nèi)出血；②既往有腦梗死病史，遺留神經(jīng)功能缺損；③合并嚴(yán)重心、肝、腎等功能不全；④存在血液系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)疾??；⑤研究前近1個(gè)月內(nèi)懷孕、分娩、哺乳者。根據(jù)梗死前出現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)與否，分為對(duì)照組(未出現(xiàn)TIA)40例與觀察組(出現(xiàn)TIA)44例。觀察組根據(jù)短暫性缺血持續(xù)時(shí)間分為A組(≤10 min，15例)、B組(10～20 min，11例)、C組(21～60 min，10例)、D組(60 min以上，8例)。對(duì)照組男26例，女14例；年齡40～70歲[(55.82±8.17)歲]；梗死部位：基底核區(qū)22例，放射冠區(qū)12例，丘腦3例，小腦2例，腦干1例。觀察組男28例，女16例；年齡40～68歲[(55.75±8.08)歲]；梗死部位：基底核區(qū)24例，放射冠區(qū)13例，丘腦4例，小腦2例，腦干1例。兩組基礎(chǔ)資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1治療方法 5組給予相同治療方法，包括：抗血小板聚集、降顱內(nèi)壓、保護(hù)腦組織細(xì)胞，降血壓，維持水、電解質(zhì)、酸堿平衡等。

1.2.2血清凋亡相關(guān)因子檢測 分別于入院第1d，治療完成后，采集患者靜脈血3 ml，離心分離血清檢測凋亡相關(guān)因子水平。以ELISA法檢測B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)、細(xì)胞色素C(Cyt)、P53、白介素-2(IL-2)含量。具體步驟如下：①試劑盒室溫平衡20 min，根據(jù)操作說明稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，復(fù)孔各2孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μl，標(biāo)準(zhǔn)孔加入100 μl稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品，待測樣品100 μl。37 ℃孵育90 min。②棄去液體，每孔加入生物素化抗體工作液100 μl，37 ℃孵育1 h。③洗板3次并拍干后，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μl，37 ℃孵育30 min。④洗板3次后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加TMB底物90 μl，37 ℃避光孵育15 min。⑤每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)。以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量各孔吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清凋亡相關(guān)因子水平。

1.3 觀察指標(biāo)①臨床治療效果。采用pullicino法計(jì)算治療前后腦梗死體積，腦梗死體積(cm3)=長×寬×CT掃描陽性層數(shù)/2。②神經(jīng)功能缺損改善情況。分別于治療前及治療后，采用NIHSS評(píng)分評(píng)價(jià)患者神經(jīng)功能缺損程度。③預(yù)后評(píng)價(jià)。預(yù)后評(píng)價(jià)于腦梗死發(fā)病后第30 d進(jìn)行，以日常生活活動(dòng)能力量表(ADL)評(píng)價(jià)，0～20分為極嚴(yán)重殘疾，21～45分為嚴(yán)重殘疾；46～70分為中度殘疾；71～95分為輕度殘疾，96分及以上為正常。ADL評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ級(jí)預(yù)后為≥46分，Ⅱ級(jí)預(yù)后<46分。④血清凋亡因子含量。包括：Bcl-2、Cyt、P53、IL-2等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死灶面積比較5組治療前梗死灶面積比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組治療后梗死灶面積顯著小于治療前(P< 0.05)，B組治療后梗死灶面積顯著小于對(duì)照組(P< 0.05)。見表1。

表1 腦梗死灶面積比較

*與對(duì)照組比較，P< 0.05

2.2 神經(jīng)功能缺損改善情況比較5組治療前NIHSS評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組治療后NIHSS評(píng)分顯著低于治療前(P< 0.05)。B組治療后NIHSS評(píng)分顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)。見表2。

表2 NIHSS評(píng)分比較 (分)

*與對(duì)照組比較，P< 0.05

2.3 預(yù)后比較治療后B組Ⅰ級(jí)預(yù)后比例顯著高于對(duì)照組(P< 0.05)。見表3。

表3 預(yù)后比較 [n(%)]

*與對(duì)照組比較，P< 0.05

2.4 血清凋亡相關(guān)因子水平比較5組治療前Bcl-2、Cyt、P53、IL-2水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組治療后血清Bcl-2水平顯著高于治療前，Cyt、P53、IL-2水平顯著低于治療前(P< 0.05)。B組治療后BCL-2水平顯著高于對(duì)照組，Cyt、P53、IL-2水平顯著低于對(duì)照組(P< 0.05)。見圖1。

圖1 治療前后血清Bcl-2、Cyt、p53、IL-2水平比較

3 討論

急性腦梗死為多見于中老年患者的神經(jīng)系統(tǒng)常見病之一，致死率、致殘率高[7，8]。發(fā)病機(jī)制尚未完全闡清，可能與下述機(jī)制有關(guān)[9]：動(dòng)脈粥樣硬化基礎(chǔ)上血栓形成，引起局部腦動(dòng)脈管腔狹窄閉塞，血液循環(huán)不足，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡、腦卒中缺血壞死?；颊呖杀憩F(xiàn)為單側(cè)肢體癱瘓，頭暈、失語等神經(jīng)功能缺損癥狀，嚴(yán)重者可昏迷不醒。盡早恢復(fù)腦補(bǔ)血供，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，縮短神經(jīng)功能損害進(jìn)展時(shí)間為臨床治療的關(guān)鍵所在。臨床研究顯示[10]，大腦缺血發(fā)生時(shí)間超過一定時(shí)限后，再次恢復(fù)血流灌注后，神經(jīng)元缺血性損傷可出現(xiàn)明顯的加重過程，即缺血再灌注損傷。腦缺血預(yù)適應(yīng)是在缺血性腦損傷發(fā)生前，給予大腦一次或多次短暫性、非致死性的缺血處理[11]，使機(jī)體獲得對(duì)下一次缺血性刺激的耐受或免疫現(xiàn)象，表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡減少，缺血灶面積縮小，腦組織損傷程度減輕等。

IP的腦保護(hù)機(jī)制尚未完全明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為[12，13]，IP可引起以腺苷為主的內(nèi)源性遞質(zhì)的釋放，通過與相關(guān)受體結(jié)合，激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，啟動(dòng)相關(guān)聯(lián)的基因，抑制神經(jīng)元壞死、凋亡等。IP對(duì)腦梗死患者血清凋亡相關(guān)因子水平的影響，尚未見報(bào)道。本研究中，筆者比較了不同缺血時(shí)間急性腦梗死患者的神經(jīng)功能、梗死灶面積及預(yù)后，結(jié)果顯示，5組治療后梗死灶面積顯著小于同組治療前，B組治療后梗死灶面積顯著小于對(duì)照組，B組治療后NIHSS評(píng)分顯著低于對(duì)照組，治療后B組Ⅰ級(jí)預(yù)后比例顯著高于對(duì)照組，說明TIA持續(xù)時(shí)間在10～20 min時(shí)，缺血耐受的產(chǎn)生效果較強(qiáng)。TIA持續(xù)時(shí)間非此時(shí)間段內(nèi)，幾乎不產(chǎn)生缺血耐受。結(jié)合文獻(xiàn)分析可能的原因?yàn)椋簳r(shí)間過短無法激活缺血耐受相關(guān)機(jī)制，時(shí)間過長又可使細(xì)胞壞死而無法獲得缺血耐受。

細(xì)胞凋亡為細(xì)胞在凋亡基因調(diào)控下，自主出現(xiàn)的有序死亡，為程序性細(xì)胞死亡。形態(tài)學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，核質(zhì)固縮，DNA降解，形成多個(gè)凋亡小體而被吞噬。近年來的研究顯示，在急性腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中，神經(jīng)細(xì)胞的凋亡具有重要的作用。缺血預(yù)適應(yīng)是否可通過改善血清凋亡相關(guān)因子，發(fā)揮腦保護(hù)作用還有待進(jìn)一步研究。本研究中，筆者檢測了缺血預(yù)適應(yīng)后，各組血清凋亡相關(guān)因子水平，包括：Bcl-2、Cyt、P53及IL-2。其中Bcl-2為膜整合蛋白[14]，定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、核膜上[15]，可使Bcl-2蛋白與Bcl-2家族的促凋亡蛋白形成異源二聚體，使促凋亡蛋白在細(xì)胞中的定位、分布保持穩(wěn)定狀態(tài)，抑制Cyt C的釋放，抑制caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞不發(fā)生凋亡。Cyt、P53為重要的細(xì)胞凋亡相關(guān)因子，其中Cyt在細(xì)胞凋亡啟動(dòng)中具有重要作用[16]，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后，可觸發(fā)caspase及非caspase級(jí)聯(lián)兩種反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。P53基因?yàn)槟[瘤抑制基因，可抑制腫瘤生長，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及捕獲G1周期[17]，通過阻滯細(xì)胞周期及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗癌作用[18]。IL-2為常見的細(xì)胞因子，可促進(jìn)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)T細(xì)胞成熟、活化，參與機(jī)體免疫應(yīng)答?？勺饔糜赥細(xì)胞，活化T細(xì)胞表面的IL-2受體，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡[19，20]。5組治療后血清Bcl-2水平顯著高于同組治療前，Cyt、P53、IL-2水平顯著低于同組治療前。B組治療后Bcl-2水平顯著高于對(duì)照組治療后，Cyt、P53、IL-2水平顯著低于對(duì)照組治療后。說明10～20 min的缺血預(yù)適應(yīng)可抑制細(xì)胞凋亡，可能為缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)急性腦梗死患者腦保護(hù)作用的機(jī)制。

綜上所述，10～20 min的缺血預(yù)適應(yīng)可顯著縮小急性腦梗死患者梗死灶面積，改善神經(jīng)功能缺損，提高預(yù)后，可能與提高血清Bcl-2水平，降低血清Cyt、P53、IL-2水平有關(guān)。