NK細胞、T淋巴細胞、調節(jié)性T細胞檢測在上消化道腫瘤病情評估中的價值

毛 菊，楊雯雯，陳 穩(wěn)，沈國棟，徐婷娟，程 民，胡世蓮

(中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽省立醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，安徽省老年醫(yī)學研究所腫瘤分子實驗室，腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室，合肥 230001)

在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,免疫系統(tǒng)起著至關重要的作用。EHRLICH[1]提出免疫監(jiān)視理論,認為免疫系統(tǒng)的一項重要功能是從人體中檢測和消除腫瘤細胞。隨著經(jīng)濟的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快以及癌癥發(fā)病率的不斷攀升，我國上消化道腫瘤患者數(shù)量日益增長，上消化道腫瘤患者常伴有免疫功能障礙，機體的免疫功能狀態(tài)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預后。檢測上消化道腫瘤患者外周血調節(jié)性T細胞、NK細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例，對患者的機體免疫功能監(jiān)測、臨床治療以及預后判斷具有重要的指導意義。鑒于此，筆者檢測102例上消化道腫瘤患者外周血中NK細胞、調節(jié)性T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞的比例，探討上述細胞比例與患者臨床分期之間的關系。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年4月中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院收治的上消化道惡性腫瘤患者102例，按腫瘤分期分為2組：對照組45例，均為Ⅱ—Ⅲ期患者，男33例、女12例，年齡42～77歲、平均(63±1)歲，病理類型：食管癌11例、胃癌34例；觀察組57例，均為Ⅳ期患者，男50例、女7例，年齡46～82歲、平均(63±1)歲，病理類型：食管癌24例、胃癌33例。2組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 入選標準

納入標準：1)所有病例均經(jīng)病理學確診符合食管癌或胃癌病理學診斷標準(參照2010版消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類)[2-3]；2)未服用激素類藥物或接受免疫抑制劑治療；3)臨床分期標準：食管癌、胃癌臨床分期依據(jù)2017年第八版AJCC，TNM分期中T、N、M的定義分別為原發(fā)腫瘤T、區(qū)域淋巴結N、遠處轉移M，臨床分期包括Ⅰ—Ⅳ期[2-3]。排除標準：1)未經(jīng)明確診斷的食管癌或胃癌；2)明確診斷為食管癌或胃癌但未做全NK、T、Treg細胞檢測者。

1.3 試劑與儀器

T細胞亞群檢測試劑盒、NK檢測試劑盒、調節(jié)性T細胞檢測試劑(包括CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5、CD45-APC)，上述試劑盒均購自美國Beckton Dickinson公司；使用BD FACS Calibur流式細胞儀(美國Beckton Dickinson公司)及Cellquest軟件進行細胞檢測與分析。

1.4 檢測方法

1.4.1 調節(jié)性T細胞檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中依次加入CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Percp-cy5.5和CD45-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.4.2 NK細胞檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD16+CD56-PE抗體，避光孵育15 min；加入500 μL BD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.4.3 T淋巴細胞亞群檢測

取50 μL抗凝外周血加入流式管，再向流式管中加入20 μL CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PERC P/CD4-APC抗體，避光孵育15 min；加入500 μLBD溶血素混勻，避光10 min，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；加入1 mL PBS溶液重懸，2000 r·min-1，5 min離心，棄上清；使用300 μL PBS溶液重懸細胞，上機檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

與對照組相比，觀察組外周血調節(jié)性T細胞的比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，外周血CD4+T細胞比例明顯降低，外周血CD8+T細胞比例、NK細胞比例明顯增高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 2組NK細胞、T淋巴細胞亞群及調節(jié)性T細胞比例比較

3 討論

腫瘤的發(fā)生與內(nèi)外環(huán)境各種因素的綜合作用相關，正常細胞受到有害刺激，惡性突變成癌細胞，繼而持續(xù)擴增形成腫瘤組織[4]。惡性腫瘤患者常伴有機體免疫功能的異常，作為細胞免疫最重要的T淋巴細胞通過功能各異的T淋巴細胞亞群來發(fā)揮免疫調控作用[5]。在上消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，機體的免疫功能也發(fā)生了顯著改變，主要表現(xiàn)為免疫防御和免疫監(jiān)視功能的降低。隨著對腫瘤免疫機制的不斷探索和腫瘤免疫營養(yǎng)治療的應用，較多的細胞免疫檢測指標用于判斷腫瘤患者的疾病狀態(tài)、治療效果及預后，其中調節(jié)性T細胞、NK細胞、T細胞亞群的測定較為常用。

調節(jié)性T細胞是具有一定免疫抑制功能的T細胞亞群，即是一群CD4+CD25+CD127low T細胞。NK細胞(CD3-CD16+/CD56+)是非抗原依賴性免疫效應細胞，可以不經(jīng)致敏直接殺傷腫瘤細胞[6]，具有抗腫瘤免疫，與細胞毒性T淋巴細胞在機體免疫防御方面發(fā)揮著重要的作用[7-8]。研究表明在胃癌中重建NK細胞功能可以很好地預防腫瘤免疫逃逸，是機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)的重要組成部分，也是機體抗御感染和防止細胞惡性轉化的重要免疫調節(jié)細胞[9]。T細胞可分為Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+CD8+)細胞。若T細胞總數(shù)或CD4+/CD8+T細胞比值降低，即可視為免疫調節(jié)功能紊亂，易發(fā)生腫瘤或自身免疫病。已有研究顯示，調節(jié)性T細胞，NK細胞，T淋巴細胞亞群測定是反映腫瘤患者的機體免疫功能狀態(tài)常用指標[10-11]。王祝榮等[13]選取226例宮頸癌患者和同期健康體檢者60例女性作為對照組,結果表明T淋巴細胞亞群與NK細胞水平可反映宮頸癌患者的細胞免疫功能,且宮頸癌臨床分期越晚,細胞免疫功能越低。王勇[14]認為測定惡性腫瘤患者外周血中T淋巴細胞亞群數(shù)目變化對臨床確定治療方案及療效觀察具有一定意義。腫瘤微環(huán)境中的T淋巴細胞具有至關重要的免疫監(jiān)視作用[15]。鐘銳等[16]認為晚期胃癌患者外周血中Treg(CD4+CD25+CD127low)細胞的表達水平明顯高于健康體檢者，且化療后降低，有助于判斷化療療效。趙強等[17]認為食管癌外周血Treg(CD4+CD25+CD127low)細胞比例能較敏感、特異地反映其細胞免疫功能狀態(tài)，有可能成為反映食管癌免疫狀態(tài)及疾病進展的外周血標志物。

本研究中Ⅳ期上消化道腫瘤患者Treg細胞的表達水平與Ⅱ、Ⅲ期相比沒有統(tǒng)計學差異，可能與本研究中病例數(shù)不夠以及將胃癌、食管癌整合在一起分析的因素相關。本研究結果顯示上消化道腫瘤臨床Ⅳ期患者CD4+T細胞的比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯降低，CD8+T細胞和NK細胞比例較Ⅱ、Ⅲ期患者明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明不同臨床分期的腫瘤患者外周血免疫狀態(tài)存在差異，臨床Ⅳ期患者的免疫功能比Ⅱ、Ⅲ期患者更差。當上消化道腫瘤患者的CD4+T細胞的比例明顯降低，CD8+T細胞比例明顯升高且調節(jié)性T細胞比例升高時表明患者目前的免疫力較差，在治療中需要考慮改善患者免疫力如采用腫瘤免疫營養(yǎng)支持治療的方法。通過檢測上消化道腫瘤患者外周血NK、T、調節(jié)性T細胞可以較早評估患者免疫狀況，對臨床診療活動具有一定的指導意義。綜上所述，檢測上消化道腫瘤患者外周血調節(jié)性T細胞、NK細胞、T淋巴細胞的比例，有助于發(fā)現(xiàn)上消化道腫瘤患者的免疫功能是否存在異常，進而指導臨床醫(yī)生對上消化道腫瘤患者的病情判斷、治療方案的制定及預后評估。