體積排阻色譜在蛋白質(zhì)藥物聚集體領(lǐng)域的應(yīng)用

張曉敏，胡志上，李紅梅*

(1.北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100013)

蛋白質(zhì)藥物是目前銷售額最大的生物治療藥物[1]，蛋白質(zhì)本身非常不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)中非共價(jià)鍵的穩(wěn)定性很容易被外力因素( 如搖動(dòng)、溫度等)破壞。加熱、延長(zhǎng)保存、有機(jī)溶劑、氧氣、pH值改變及其他多種因素均可引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。作為蛋白質(zhì)產(chǎn)品的蛋白藥，在生產(chǎn)過程中需要進(jìn)行酸處理、熱處理和機(jī)械處理，這些過程中都有可能產(chǎn)生蛋白質(zhì)折疊甚至聚集；蛋白藥在貯藏、運(yùn)輸、銷售以及用藥過程中由于外力因素的作用也可能會(huì)產(chǎn)生聚集。蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致蛋白藥活性降低，藥品中的蛋白單體濃度降低，并可能產(chǎn)生有害的毒理學(xué)作用和免疫應(yīng)答，甚至?xí)l(fā)生危及生命安全的藥物反應(yīng)[2]。

體積排阻色譜(Size exclusion chromatography,SEC)靈敏度良好、操作簡(jiǎn)單、樣品前處理少、分析速度快、分離條件溫和[3]，自重組蛋白藥物誕生以來一直是蛋白質(zhì)藥物聚集體表征的金標(biāo)準(zhǔn)[4-6]。蛋白質(zhì)聚集體檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過多年發(fā)展，現(xiàn)已有20多種，常用聚集體檢測(cè)技術(shù)[7-10]如圖1所示。然而這些方法在檢測(cè)、定量聚集體方面均有一定的局限，如：動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)只能用作初步定性工具，沒有分離篩選能力；非對(duì)稱流場(chǎng)流、分析超速離心技術(shù)定量表征聚集體不如SEC準(zhǔn)確；納米粒子示蹤技術(shù)僅適用于粒子濃度范圍為107～109顆/毫升(particles/mL)的蛋白質(zhì)聚集體表征,為了達(dá)到合適的顆粒濃度通常需要對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，會(huì)對(duì)測(cè)量產(chǎn)生一定的干擾；光透法、流式成像技術(shù)在測(cè)量蛋白質(zhì)樣品時(shí)容易受到折射率和稀釋倍數(shù)的影響，從而使測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確。綜上，SEC依舊是目前表征蛋白質(zhì)藥物聚集體最常用的技術(shù)。該技術(shù)在監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性和降解模式方面發(fā)揮著重要作用，對(duì)于指導(dǎo)蛋白質(zhì)藥物篩選及純化工藝的開發(fā)具有重要意義。本文介紹了SEC的分離原理并對(duì)其在蛋白質(zhì)藥物聚集體檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用做了歸類,同時(shí)介紹了該技術(shù)在蛋白質(zhì)藥物聚集體應(yīng)用中存在的不足及優(yōu)化方法，最后對(duì)其發(fā)展前景做了簡(jiǎn)要概括。

圖1 檢測(cè)蛋白質(zhì)大小(直徑)的方法及其檢測(cè)范圍[7]Fig.1 Methods for detecting protein size and its detection range [7]

1 體積排阻色譜原理

SEC根據(jù)流體動(dòng)力學(xué)半徑(Hydrodynamic radius)分離大分子化合物，其固定相由嚴(yán)格控制孔徑的球形多孔顆粒組成，大分子化合物根據(jù)其分子體積大小差異以水性緩沖液作為流動(dòng)相進(jìn)行擴(kuò)散[4]。Engelhardt等[6]提出以保留因子k*作為溶質(zhì)在孔內(nèi)滯留流動(dòng)相與顆粒間流動(dòng)相的比。在SEC中，該k*值是有限的，其最大值由色譜柱的孔體積(VP)和粒間孔體積(VZ)的比值給出:

(1)

(2)

式中，Velu代表從進(jìn)樣開始計(jì)算的通過色譜柱的實(shí)際淋洗體積。對(duì)于給定的色譜柱，其最大值k*是固定的，隨著分子量增加，分子體積相應(yīng)增大，溶質(zhì)流經(jīng)的總孔體積減少，進(jìn)而導(dǎo)致峰展寬。目前最先進(jìn)的色譜柱的最大保留因子k*約為1.6～1.8。通過引入k*，Engelhardt得出了以下半經(jīng)驗(yàn)關(guān)系來描述色譜柱性能：

(3)

其中，H為板高；dP為粒徑；DM為分子擴(kuò)散系數(shù)；u為流動(dòng)相線速度。

一般對(duì)于液相色譜，兩組分的分離度為：

(4)

其中，tR,j、tR,i分別為兩組分的保留時(shí)間；wi、wj為兩組分對(duì)應(yīng)的峰寬。

在SEC中由于H與u有關(guān)或與其保留體積VR有關(guān)，上述R的概念不完全適用，故引入

(5)

其中，ΔVR(ΔVR=VR,i-VR,j)為兩組分保留體積之差；σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差(與峰寬成正比)；Mi、Mj為兩組分的分子量(Molarmass),且Mi>Mj。當(dāng)兩組分的分子量差一個(gè)數(shù)量級(jí)(Mi=10Mj)時(shí),認(rèn)為兩個(gè)分離度是相等的。

通常流速越低，其分離效果越好，同時(shí)分析時(shí)間越長(zhǎng)。一般可以通過減小固定相粒徑、減少色譜柱長(zhǎng)度以及增加流速來縮短分析時(shí)間[4]。已有研究報(bào)道了柱長(zhǎng)和流動(dòng)相流速對(duì)SEC分離的影響。Popovici等[11]以1 mg/mL的四氫呋喃為流動(dòng)相，聚苯乙烯混合物為樣本，考察了流速為0.3、0.5、0.7、1.0、1.2、1.4、1.6 mL/min時(shí)對(duì)其分辨能力的影響，結(jié)果顯示0.3、0.5 mL/min流速下的分離效果最好，當(dāng)增加流速時(shí)分辨率下降，分析時(shí)間減少，且當(dāng)流速大于1.0 mL/min時(shí)其分辨能力下降更快。Ricker等[12]使用ZorbaxGF-250色譜柱(250 mm×9.4 mm)研究流速對(duì)SEC分辨能力的影響時(shí)也得出相同結(jié)論，且增加色譜柱長(zhǎng)度，分辨能力增加，因此優(yōu)化SEC方法時(shí)需要綜合考慮分辨率以及分析時(shí)間。

2 SEC在蛋白質(zhì)藥物聚集體檢測(cè)中的實(shí)際應(yīng)用

SEC原理簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度良好，常被用于質(zhì)量控制[2],是評(píng)估聚集體形成的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一，在實(shí)際使用中常與多種檢測(cè)器聯(lián)用，如UV、RI(示差折光檢測(cè)器)、多角度光散射(MALS)和粘度計(jì)等。SEC可以通過得到準(zhǔn)確的分子量以及洞察與聚集相關(guān)的降解途徑和產(chǎn)物來增強(qiáng)蛋白質(zhì)表征[13],如Kiminami等[14]通過SEC聯(lián)用紫外、多角度靜態(tài)光散射(SEC-UV-MALS)技術(shù)評(píng)估了滅菌方法對(duì)聚合物基注射器中促紅細(xì)胞生成素(EPO)儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響。Lancaster等[15]使用SEC聯(lián)用光散射、紫外、示差折光檢測(cè)(SEC-HPLC-MALS-UV-RI)的方法來表征針對(duì)艱難梭菌疫苗(Clostridium difficile vaccine)的4種不同蛋白質(zhì)抗原的聚集水平。SEC聯(lián)用紫外、質(zhì)譜檢測(cè)器(Native SEC-UV-MS)還可以表征低豐度和非共價(jià)蛋白質(zhì)尺寸變體，并且為分析混合抗體藥物的物理(聚合)和化學(xué)(共價(jià)修飾和碎裂)降解過程、研究抗體-抗原相互作用和其他主要類別的生物藥物如Fc融合蛋白和蛋白質(zhì)支架提供強(qiáng)大的平臺(tái)[16]。SEC在監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性和降解模式方面發(fā)揮著重要作用，同時(shí)也被用來研究蛋白質(zhì)藥物的聚集機(jī)制。

2.1 在蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性方面的應(yīng)用

Al-Ghobashy等[17]將SEC作為一種技術(shù)手段研究了pH值對(duì)蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明蛋白質(zhì)藥物的降解與溶劑的pH值有關(guān)，在較低pH值時(shí)蛋白質(zhì)藥物降解程度最低?？贵w藥物偶聯(lián)物(Antibody-drug conjugate,ADC)將單克隆抗體的特異性靶向特性與小分子藥物的極高效能相結(jié)合[18-19]，是復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物治療劑。ADC由3部分組成：?jiǎn)慰寺】贵w、細(xì)胞毒性藥物以及將抗體和小分子藥物連在一起的接頭。Li等[20]將SEC與在線二維色譜中的反相色譜(RP-HPLC)聯(lián)用，用于ADC藥物制劑在不同溫度和配方pH值下穩(wěn)定性的研究。該技術(shù)可直接在ADC樣品中鑒定和定量未結(jié)合的小分子藥物和相關(guān)的小分子雜質(zhì)，其中SEC方法在第一維不僅能將小分子雜質(zhì)與完整的ADC分開，而且還能提供關(guān)于ADC的尺寸(單體、二聚體、多聚集體等)二維信息。

2.2 在抗體包裝產(chǎn)品穩(wěn)定性檢測(cè)中的應(yīng)用

長(zhǎng)久以來，藥物注射器大部分采用玻璃制成。已有研究表明玻璃注射器潤(rùn)滑所需的硅油會(huì)引起某些蛋白質(zhì)(包括蛋白質(zhì)藥物)的聚集[21-23]，目前其與蛋白質(zhì)的相互作用仍然是一個(gè)熱門研究領(lǐng)域。Felsovaly等[24]發(fā)現(xiàn)來自針筒的硅油滴會(huì)干擾蛋白質(zhì)聚集體的定量和表征。SEC作為檢測(cè)蛋白質(zhì)聚集體的常用技術(shù)，被用于預(yù)填充注射器以及其他抗體藥物包裝中蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性的研究。如Waxman等[25]運(yùn)用SEC作為其中一種技術(shù)手段研究幾種蛋白質(zhì)樣品在靜態(tài)條件下和受到機(jī)械應(yīng)力刺激時(shí)存儲(chǔ)在由硅化玻璃以及無硅塑料制成的預(yù)填充注射器中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明無硅塑料制成的注射器中蛋白質(zhì)聚集體更少。Sugimoto等[26]在評(píng)估外部配藥藥房用一次性玻璃瓶和玻璃安瓿瓶中重新包裝的Avastin?(貝伐單抗)的穩(wěn)定性和功效研究中，使用SEC來定量重新包裝的貝伐單抗樣品單體和可溶性聚集物水平，結(jié)果表明貝伐單抗在安瓿瓶和一次性玻璃瓶中復(fù)配后保持穩(wěn)定，沒有觀察到顯著的聚集、片段化或生物活性喪失。

2.3 聚集機(jī)制研究

SEC作為一種技術(shù)手段也被科研人員用來研究蛋白質(zhì)的聚集機(jī)制。Xiong等[27]在研究阿爾茨海默病相關(guān)的Aβ(β-淀粉樣蛋白)肽Aβ(25～40)的聚集機(jī)制中將SEC作為其中一種技術(shù)手段，評(píng)估樣品的初始聚集體分布。Paul 等[28]通過SEC技術(shù)發(fā)現(xiàn)4號(hào)單抗株(mAb4)及其Fab片段的霧化導(dǎo)致其單體含量顯著降低，Sadavarte等[29]在研究中采用SEC和疏水相互作用膜色譜確定單克隆抗體寡聚體解聚的程度,結(jié)果顯示熱循環(huán)導(dǎo)致樣品二聚體分解。

3 SEC在蛋白質(zhì)藥物聚集體分析中存在的不足及優(yōu)化方法

SEC方法靈敏度良好、重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)速度快，在蛋白質(zhì)藥物聚集體分析中得到了廣泛使用。但其在實(shí)際應(yīng)用中仍存在一定的不足，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)藥樣品與SEC固定相之間的非特異性相互作用[30]會(huì)導(dǎo)致洗脫延遲，色譜峰拖尾，基線漂移，蛋白質(zhì)回收率低等問題，其次，由于SEC檢測(cè)范圍有限，而蛋白質(zhì)藥物形成的聚集體尺寸范圍較大(從簡(jiǎn)單的二聚體到可以被SEC色譜柱過濾掉的大的多聚體),導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。以下將針對(duì)這兩個(gè)問題做簡(jiǎn)要探討。

SEC用于蛋白質(zhì)藥物分析時(shí)，蛋白質(zhì)藥物聚集體比單體更容易與柱基產(chǎn)生非特異性相互作用，導(dǎo)致分析不準(zhǔn)確、可能檢測(cè)不到對(duì)產(chǎn)品安全性或功效有顯著影響的聚集體[31]。通常，新的SEC色譜柱會(huì)更容易吸附蛋白質(zhì),且初次進(jìn)樣會(huì)比多次進(jìn)樣吸附蛋白嚴(yán)重。其次，蛋白質(zhì)藥物的配方即溶劑和SEC流動(dòng)相并不完全適配，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)藥樣品被注入與其成分不同的流動(dòng)相時(shí)，會(huì)增加蛋白質(zhì)樣品與SEC柱的非特異性吸附，也會(huì)對(duì)其非共價(jià)聚集體的分布造成一定的干擾，導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確。因此選擇合適的流動(dòng)相以及低吸附的色譜柱對(duì)于SEC方法優(yōu)化是必須的。

但隨著SEC色譜柱填料的發(fā)展，一些研究表明，在采用新型填料時(shí)，蛋白質(zhì)樣品與柱基的非特異性相互作用基本可以忽略。如Goyon等[32]在研究鈉、鉀添加劑對(duì)SEC分離蛋白質(zhì)藥物與聚集體的影響時(shí)，分別采用了安捷倫公司(Agilent Technologies)的AdvanceBioSEC色譜柱、日本Tosoh(Tokyo,Japan)公司的TSKgel UP-SW3000色譜柱以及美國(guó)Waters(Milford,MA,USA)的ACQUITY UPLC BEH200色譜柱，通過SEC耦合在線熒光光譜法測(cè)定，發(fā)現(xiàn)10個(gè)商業(yè)單克隆抗體的聚集水平在3個(gè)不同的UHP-SEC柱上相似，表明3個(gè)SEC色譜柱填料對(duì)蛋白質(zhì)藥物聚集體影響低，其非特異性相互作用可以忽略不計(jì)。因此本文側(cè)重于討論流動(dòng)相的優(yōu)化。

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

一般情況下，流動(dòng)相低到中的鹽濃度可降低蛋白質(zhì)藥物樣品與SEC固定相的相互作用，使蛋白質(zhì)樣品洗脫時(shí)間正常且回收率提高，高濃度鹽則會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)鹽析。如Kamberia等[33]使用TSK-G2000SW色譜柱以人甲狀腺激素(Human parathyroid hormone,hPTH)(1～34)為樣品分析了NaCl濃度對(duì)樣品非共價(jià)聚集體回收率的影響。結(jié)果表明,增加鹽濃度且當(dāng)NaCl為100 mmol/L時(shí)，其回收率達(dá)到最大(78.2 %)，NaCl為600 mmol/L時(shí),由于鹽析，樣品回收率降為0。Ricker等[12]使用ZorbaxBioSeries GF-250(250 mm×9.4 mm 或 250 mm×4.6 mm)色譜柱研究了不同鹽濃度流動(dòng)相對(duì)3種抗體的影響，其中3種抗體最佳鹽濃度為0.1～0.2 mol/L，當(dāng)鹽濃度<0.1 mol/L時(shí)，樣品回收率快速增加，鹽濃度為0.1～0.4 mol/L時(shí)達(dá)到平緩，當(dāng)鹽濃度大于0.4 mol/L時(shí)回收率快速降低。保留時(shí)間在該鹽濃度范圍內(nèi)無顯著變化。

氨基酸在遠(yuǎn)紫外區(qū)均有光吸收，目前很少用于SEC流動(dòng)相中，但一些研究表明氨基酸可以減少或抑制蛋白質(zhì)樣品與硅膠柱基的非特異性相互作用，如精氨酸。Yumioka等[34]使用兩根新的TSKgel G3000SWXL色譜柱，分別以pH 6.8的0.2 mol/L NaCl緩沖液以及0.2 mol/L(arginine HCl)精氨酸緩沖液為流動(dòng)相，對(duì)比了鼠源抗體mIgG1在相同流速、相同進(jìn)樣量條件下的分離度以及回收率。結(jié)果表明，在精氨酸緩沖溶液中蛋白樣本單體和二聚體的分離度優(yōu)于氯化鈉緩沖溶液(精氨酸緩沖溶液中樣品單體和二聚體分離度為1.36，氯化鈉緩沖溶液中為1.25)，同時(shí)該樣品在精氨酸緩沖溶液中的回收率優(yōu)于氯化鈉緩沖溶液中，該研究還發(fā)現(xiàn)樣品在精氨酸緩沖溶液下的聚集體含量顯著高于氯化鈉緩沖溶液。

加入去垢劑也可以抑制蛋白樣品與固定相的相互作用，但由于去垢劑會(huì)與蛋白樣品結(jié)合，可能破壞蛋白樣品的非共價(jià)聚集體，所以一般很少在SEC分析蛋白質(zhì)藥樣品[31]中使用。微量的去垢劑是否可以在不破壞非共價(jià)聚集體的情況下抑制蛋白樣品與柱基的吸附作用還有待進(jìn)一步研究。

3.2 檢測(cè)范圍難以覆蓋整個(gè)蛋白質(zhì)聚集體

蛋白質(zhì)藥物聚集體通常被認(rèn)為是產(chǎn)品降解產(chǎn)物，尺寸范圍包括納米級(jí)的二聚體以及數(shù)百微米肉眼可見的顆粒[35]。聚集是影響蛋白質(zhì)藥物安全性和功效的重要問題，并與蛋白質(zhì)免疫原性有關(guān)[7]。因此需要準(zhǔn)確定量表征蛋白質(zhì)聚集體以滿足臨床要求。SEC由于自身?xiàng)l件，如色譜柱填料、色譜柱長(zhǎng)等導(dǎo)致檢測(cè)范圍存在一定限制，為了確保該技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)藥物聚集體的可靠性以及準(zhǔn)確性，本文提出幾種常用的檢測(cè)手段，作為SEC驗(yàn)證時(shí)的補(bǔ)充技術(shù)。

3.2.1 與聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)或十二烷基硫酸鈉毛細(xì)管電泳(CE-SDS)技術(shù)聯(lián)合使用SDS-PAGE是一種非常常見、相當(dāng)穩(wěn)健的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，可以提供樣品近似分子量和數(shù)量信息。SDS的存在意味著非共價(jià)聚集體被破壞，所以該方法僅可檢測(cè)共價(jià)聚集體。如果使用還原條件，SDS-PAGE可以區(qū)分由二硫鍵連在一起的聚集體和由其他(不可還原的)共價(jià)鍵連在一起的聚集體。目前SDS-PAGE正在被更適合量化的毛細(xì)管電泳CE-SDS所取代。使用CE-SDS可以自動(dòng)運(yùn)行樣品并通過紫外吸收而不是染料結(jié)合進(jìn)行定量，實(shí)現(xiàn)與SDS-PAGE類似的結(jié)果。SEC和SDS-PAGE和/或CE-SDS的組合通常是質(zhì)控分析的一部分[2]。如Turner等[36]使用SEC、CE-SDS、動(dòng)態(tài)光散射(DLS)以及流式成像技術(shù)(FI)等技術(shù)對(duì)NIST單克隆抗體進(jìn)行大小變異體監(jiān)控，其中優(yōu)化過的CE-SDS以及SEC技術(shù)可涵蓋大小約為100 nm及以下的大小變異體，在監(jiān)視抗體結(jié)構(gòu)、純度及穩(wěn)定性方面發(fā)揮了重要作用。Dada等[37]對(duì)比了SEC與CE-SDS技術(shù)在監(jiān)測(cè)IgG1單克隆抗體降解中的應(yīng)用，研究表明CE-SDS可作為SEC在監(jiān)測(cè)抗體鉸鏈區(qū)片段化中的替代技術(shù)，同時(shí)兩種技術(shù)相結(jié)合可以獲得抗體片段化較為全面的表征。Buecheler等[38]在其研究中采用SEC與非還原狀態(tài)下的SDS-PAGE技術(shù)檢測(cè)釀膿鏈球菌來源的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglubulin G-degrading enzyme of Streptococcus pyogenes,IdeS)對(duì)IgG1單克隆抗體的消化速率，結(jié)果表明使用IdeS幾乎可以使該實(shí)驗(yàn)中IgG1單克隆抗體完全消化(消化蛋白量> 98%)。

3.2.2 與分析超速離心法(Analytical ultracentrifugation,AUC)技術(shù)聯(lián)合使用AUC是表征大分子沉降行為和溶液中聚集體存在的有力技術(shù)，主要應(yīng)用沉降速度模式(SV-AUC)。AUC的主要優(yōu)點(diǎn)之一是蛋白質(zhì)樣品通常可以在其樣品緩沖液中無需樣品前處理進(jìn)行表征。減少了由樣品制備、稀釋或基質(zhì)效應(yīng)引起的樣品中聚集體的形成或破壞。由于沒有目標(biāo)分子與色譜柱或膜的相互作用，AUC是定性交叉核對(duì)或檢驗(yàn)由SEC 獲得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的有利工具[2]。 AUC可用于驗(yàn)證樣本中可能存在的聚合類型是否被SEC漏掉。Philo[9]發(fā)現(xiàn)用SEC檢測(cè)的單體峰如果用SV-AUC分析,則包含單體和二聚體。Gervais等[39]將AUC與SEC技術(shù)聯(lián)合使用，在對(duì)堿性蛋白質(zhì)高聚物進(jìn)行定量分析的過程中發(fā)現(xiàn)，SEC方法開發(fā)中應(yīng)評(píng)估堿性蛋白質(zhì)與柱基的非特異性結(jié)合作用，以確保對(duì)較大聚集物的分辨能力不受影響。

3.2.3 與動(dòng)態(tài)光散射(DLS)技術(shù)聯(lián)合使用DLS(Dynamic light scattering)是一種用于測(cè)定粒徑在1～2 nm到3～5 μm范圍內(nèi)粒徑分布的非破壞性技術(shù)[2]。該技術(shù)一般用于蛋白質(zhì)藥物穩(wěn)定性研究。Al-Ghobashy等在SEC與DLS技術(shù)檢測(cè)pH值對(duì)生物制藥穩(wěn)定性影響的研究中，使用DLS技術(shù)觀察到了SEC色譜圖中未觀察到的高分子聚合物的存在[17]。

3.2.4 與流場(chǎng)流分離(Flow field-flow fractionation(F4))技術(shù)聯(lián)合使用F4最近已被美國(guó)食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)為蛋白質(zhì)產(chǎn)品驗(yàn)證中SEC的補(bǔ)充技術(shù)[40]，其小型化中空纖維流場(chǎng)分離(Hollow fiber flow field-flow fractionation，HF5)技術(shù)顯示了以下優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)范圍較寬、分離機(jī)理溫和、稀釋倍數(shù)低和靈敏度高。為此Marassi等[40]提出將HF5作為評(píng)估單克隆抗體樣品中聚集體含量的補(bǔ)充技術(shù)，并對(duì)SEC和HF5性能進(jìn)行了比較研究，證明了SEC和HF5之間的互補(bǔ)性以及它們被用作蛋白質(zhì)藥物表征和質(zhì)量控制方法的可行性。

3.2.5 與其他多種方法聯(lián)合使用SEC靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、樣品前處理少、分析速度快、分離條件溫和[3]，自重組蛋白藥物誕生以來一直是蛋白質(zhì)藥物聚集體表征的金標(biāo)準(zhǔn)。然而在實(shí)際應(yīng)用過程中仍存在由于蛋白質(zhì)與固定相的非特異性相互作用所導(dǎo)致的洗脫延遲、色譜峰拖尾、基線漂移、蛋白質(zhì)回收率低等問題。其次，由于該技術(shù)分離大分子化合物的尺寸范圍有限，而蛋白質(zhì)聚集體大小范圍包括納米級(jí)的二聚體以及數(shù)百微米級(jí)的肉眼可見顆粒，因此需要結(jié)合多種技術(shù)來獲得有關(guān)蛋白質(zhì)聚集體形成方式及其結(jié)構(gòu)、大小等的全面信息。He等[41]開發(fā)了SEC與混合模式液相色譜(LC)在線偶聯(lián)的方法，該方法允許同時(shí)測(cè)量蛋白質(zhì)藥物中各種組分，包括活性藥物成分(蛋白質(zhì))和各種賦形劑，如陽離子、陰離子、非離子疏水表面活性劑和親水性糖類等。Li等[20]開發(fā)了一種使用SEC和RP-HPLC二維色譜模式的技術(shù)，用于直接分析抗體藥物偶聯(lián)物(Antibody drug conjugates,ADC)中的游離藥物和相關(guān)小分子雜質(zhì)。近年來不斷涌現(xiàn)的分析儀器及方法也為SEC與其他多種方法聯(lián)合使用，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集體全面表征提供了可能。如Hu等[42]在實(shí)驗(yàn)室搭建了一款新的流式細(xì)胞儀(FC,Flow cytometry)，該儀器可以輕松檢測(cè)低至200 nm左右的標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯微球以及微米級(jí)別的二氧化硅顆粒，通過該儀器對(duì)比不同加熱時(shí)間、加熱溫度下單克隆抗體的聚集情況，結(jié)果表明該儀器可以檢測(cè)到大小為0.2～10 μm的蛋白質(zhì)聚集體，該技術(shù)為蛋白質(zhì)聚集體表征技術(shù)的選擇提供了新的參考。Yoneda等[43]比較研究了定量光散射技術(shù)(Quantitative laser diffraction,qLD)與共振質(zhì)量測(cè)量技術(shù)(Resonant mass measurement,RMM)、納米粒子示蹤技術(shù)(Nanoparticle tracking analysis,NTA)、流式成像技術(shù)(Flow imaging,FI)以及光透法(Light obscuration,LO)在蛋白質(zhì)聚集體定量表征中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)qLD和RMM 在粒徑范圍0.3～2 μm之間時(shí)數(shù)據(jù)具有良好一致性，同時(shí)qLD與FI技術(shù)在粒徑范圍2～20 μm之間時(shí)數(shù)據(jù)具有良好一致性，從而為蛋白質(zhì)聚集體表征技術(shù)的組合提出了新方法。

4 結(jié)語與展望

綜上所述，SEC目前仍然是蛋白質(zhì)藥物開發(fā)、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性研究中最常用的方法。該技術(shù)適用于1～50 nm范圍內(nèi)聚集體的分析。當(dāng)不引起樣品聚集狀態(tài)的變化且可消除與柱填充介質(zhì)的非特異性相互作用時(shí)，SEC被認(rèn)為是穩(wěn)健且準(zhǔn)確的。