食源性致病菌等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

葛 航，吳朦晨，張明洲，俞曉平

(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

圖1 世界范圍內(nèi)食源性風(fēng)險(xiǎn)因子危害程度分析[1]Fig.1 Global burden of diseases caused by food-borne factors[1]the percentage was calculated by dividing number of deaths caused by certain factor over total number of deaths

微生物與食品安全有著密切的關(guān)系，有益微生物被廣泛應(yīng)用于食品制造與加工過(guò)程；有害微生物則會(huì)導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)或直接危害人類(lèi)健康，引起食品安全事件。世界衛(wèi)生組織最新的食源性疾病調(diào)查報(bào)告顯示，全世界因食源性風(fēng)險(xiǎn)因子致病的人數(shù)超過(guò)6億人，死亡人數(shù)超過(guò)41萬(wàn)人，其中因細(xì)菌導(dǎo)致死亡的人數(shù)超過(guò)24萬(wàn)人，占總死亡人數(shù)的59.60%[1](圖1)。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委統(tǒng)計(jì),2011～2016年我國(guó)因微生物引起的食物中毒事件為2 446起，占食物中毒事件的25.5%，致病人數(shù)達(dá)4.82萬(wàn)人，占總致病人數(shù)的43.3%，其中以腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis)和副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)為代表的食源性致病菌是引發(fā)食品安全事件的主要因子[2]。2018年8月25日發(fā)生在桂林的百人以上集體食物中毒事件，就是因參會(huì)人員食用了被沙門(mén)氏菌污染的食物所致。對(duì)食源性致病菌進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)或在線快速精準(zhǔn)檢測(cè)是保障公眾安全的重要手段，無(wú)論是對(duì)突發(fā)性食品安全事件的快速響應(yīng)，或是對(duì)高危害性致病菌的有效防控，都需要相應(yīng)的快速檢測(cè)方法作為支撐。然而，細(xì)菌微小的個(gè)體和復(fù)雜的種類(lèi)，使得對(duì)其準(zhǔn)確鑒定具有一定的困難，這也凸顯了開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確而又高效的致病菌檢測(cè)方法的必要性和迫切性。

1 食源性致病菌核酸檢測(cè)方法

微生物的傳統(tǒng)鑒別方法(培養(yǎng)法)一般基于其形態(tài)和生化特性，需要經(jīng)過(guò)選擇性增菌、分離菌株、擴(kuò)增培養(yǎng)、制片觀察形態(tài)等常規(guī)生化鑒定和毒素鑒定步驟。培養(yǎng)法雖然判定準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性強(qiáng)，但耗時(shí)通常為5～6天，且對(duì)檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)和技巧要求較高。因此，培養(yǎng)法在一些需要做出快速反應(yīng)或檢測(cè)量大的現(xiàn)場(chǎng)或在線檢測(cè)中局限較大。除此之外，有些細(xì)菌能夠進(jìn)入不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but non culturable，VBNC)，即菌體具有活性但無(wú)法被培養(yǎng)，這種情況會(huì)導(dǎo)致所檢測(cè)的細(xì)菌數(shù)量被低估[3]。因此，基于形態(tài)觀察和生化鑒定的傳統(tǒng)方法雖然可作為最終的仲裁方法，卻無(wú)法在有限的時(shí)間內(nèi)完成對(duì)大量樣品的篩查，恰恰相反，這正是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)為代表的致病菌核酸檢測(cè)方法所具備的優(yōu)點(diǎn)。

PCR方法以細(xì)菌特異性核酸序列作為檢測(cè)目標(biāo)，簡(jiǎn)化了判斷細(xì)菌種類(lèi)的標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，提高了檢測(cè)靈敏度。PCR技術(shù)的結(jié)果非?？煽?，一方面，細(xì)菌的特征基因具有非常高的特異性，在其他細(xì)菌種類(lèi)中可能不存在或者序列不同，即使是種間較為保守的基因，如16S基因，也在不同種類(lèi)間具有多樣性的特定區(qū)域，序列完全相同的可能性極低；另一方面，通過(guò)DNA測(cè)序技術(shù)，能夠獲得詳細(xì)的序列堿基組成和排列信息，為判斷是否檢測(cè)到靶標(biāo)基因提供可靠證據(jù)。同時(shí)，以核酸為靶標(biāo)的檢測(cè)方法檢測(cè)通量高、檢測(cè)時(shí)間短，在檢測(cè)效率上有著明顯的優(yōu)勢(shì)。由于PCR的以上諸多優(yōu)點(diǎn)，相關(guān)研究在近十年呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖2)，在國(guó)標(biāo)中一些致病菌的檢測(cè)方法也采用了PCR方法(表1)。

圖2 沙門(mén)氏菌PCR檢測(cè)方法研究情況Fig.2 Publications of Salmonella spp.detection methods targeting specific genes(data were derived from Web of Science)A.PCR based methods for Salmonella spp.(沙門(mén)氏菌核酸擴(kuò)增方法研究數(shù)量);B.isothermal amplification based methods for Salmonella spp.(沙門(mén)氏菌等溫?cái)U(kuò)增方法研究數(shù)量)

2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

經(jīng)典的PCR方法能夠在幾小時(shí)內(nèi)完成對(duì)目標(biāo)核酸的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，具有檢測(cè)時(shí)間短、適用范圍廣的優(yōu)勢(shì)，但也存在明顯的缺陷。PCR過(guò)程需要經(jīng)歷變性、退火、延伸3個(gè)步驟的多次循環(huán)，而且每一個(gè)步驟都需要在特定的溫度下進(jìn)行，通常分別為94、55、72 ℃。變溫循環(huán)要求PCR儀器配備快速變溫單元，導(dǎo)致儀器不便移動(dòng)和攜帶，而實(shí)際應(yīng)用中又存在著大量現(xiàn)場(chǎng)或在線檢測(cè)的需求，由此催生了多種可在恒溫條件下進(jìn)行的PCR技術(shù)，稱為等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling circle amplification，RCA)、鏈置換擴(kuò)增(Strand displacement amplification，SDA)、切口酶信號(hào)擴(kuò)增(Nicking enzyme signal amplification，NESA)和核酸外切酶Ⅲ輔助擴(kuò)增(Exonuclease Ⅲ assisted amplification)技術(shù)等[4-6]，詳見(jiàn)表2。這些技術(shù)不需要復(fù)雜的溫度變化，在一個(gè)恒定溫度下就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)目標(biāo)或者信號(hào)的擴(kuò)增，極大地降低了對(duì)儀器的需求，具有現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用或在線檢測(cè)的潛力。

表2 常見(jiàn)5種等溫?cái)U(kuò)增方法比較Table 2 Comparison of 5 isothermal amplification methods

2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP技術(shù)是目前最為常用的病原菌現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)，在2000年首次提出[7]。與傳統(tǒng)PCR不同，LAMP技術(shù)針對(duì)模板6個(gè)不同區(qū)域的位置，設(shè)計(jì)可以自發(fā)形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的引物，在不斷復(fù)制中將線性的目標(biāo)DNA序列無(wú)限拓展為之字形的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)。盡管LAMP的反應(yīng)過(guò)程非常復(fù)雜，但是結(jié)果的判斷卻簡(jiǎn)便、可視。這是由于反應(yīng)產(chǎn)生的大量焦磷酸離子與鎂離子形成了難溶于水的焦磷酸鎂沉淀，使得肉眼即可定性判別檢測(cè)結(jié)果。但更精確的定量判斷則需要借助于濁度計(jì)或使用能識(shí)別DNA雙鏈的核酸染料[8]。目前，研究人員已經(jīng)成功地將LAMP技術(shù)應(yīng)用于多種致病微生物的檢測(cè)中，包括單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[9-11]、沙門(mén)氏菌(Salmonellaspp.)[12-14]、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)[15-17]、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(EscherichiacoliO157)[18]、副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[19-21]和霍亂弧菌(Vibriocholerae)[22-24]等。LAMP方法擴(kuò)增速度快、靈敏度高、無(wú)需變溫，在所有等溫?cái)U(kuò)增方法中應(yīng)用最廣。但是，LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物組成復(fù)雜，多種長(zhǎng)度片段共存的產(chǎn)物起不到再次驗(yàn)證擴(kuò)增特異性的作用；此外，60 ℃的反應(yīng)溫度仍然需要裝置維持；極快的擴(kuò)增速率也增加了假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。這些缺點(diǎn)是LAMP技術(shù)所亟待解決的。

圖3 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)原理示意圖Fig.3 Principle of rolling circle amplification

2.2 滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)

RCA的原理與滾環(huán)復(fù)制有很多相似之處，滾環(huán)復(fù)制是噬菌體和病毒常見(jiàn)的環(huán)狀雙鏈DNA復(fù)制方式，由具有3端至5端外切酶活性的DNA聚合酶Ⅲ在切口處同步進(jìn)行新鏈合成和原有鏈去除[25]。RCA技術(shù)只使用單側(cè)引物，結(jié)合在環(huán)形待檢測(cè)的核酸序列上，在聚合酶的作用下，不斷循環(huán)復(fù)制，形成不斷重復(fù)并且與環(huán)形模板互補(bǔ)的DNA長(zhǎng)鏈[26]；待測(cè)核酸非環(huán)狀類(lèi)型時(shí)，可將鎖狀引物(Padlock probe)與待測(cè)線型核酸結(jié)合，使用DNA連接酶連成環(huán)形，以鎖狀引物的序列代替核酸序列進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而使用相應(yīng)策略檢測(cè)引物的數(shù)量(圖3)。Zhou等[27]巧妙地將一小段雙鏈結(jié)構(gòu)加入到鎖狀引物中，形成啞鈴型。由于雙鏈結(jié)構(gòu)的存在，RCA擴(kuò)增的長(zhǎng)鏈DNA中也會(huì)形成多個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)，在反應(yīng)體系中加入嵌入型熒光染料，即可對(duì)雙鏈結(jié)構(gòu)的數(shù)目做出估計(jì)，達(dá)到對(duì)目標(biāo)核酸序列定量分析的目的。Guo等[28]將RCA與氯高鐵血紅素的氧化還原反應(yīng)結(jié)合，用于大腸桿菌(Escherichiacoli)的定量測(cè)定。Teng等[19]先用抗體與適配體混合的夾板式方法捕獲目標(biāo)菌體，再通過(guò)RCA技術(shù)放大信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)魚(yú)肉中副溶血弧菌的精準(zhǔn)測(cè)定。由于鎖狀引物的序列是人為設(shè)計(jì)的，因此RCA的產(chǎn)物序列具有很強(qiáng)的拓展性，可以根據(jù)實(shí)際需要來(lái)調(diào)整，以便形成具有信號(hào)產(chǎn)生功能或者催化活性的DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)，也易于實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。此外，RCA的產(chǎn)物在空間上是連續(xù)的，因此是唯一可進(jìn)行原位擴(kuò)增的等溫?cái)U(kuò)增策略，特別適合在芯片表面進(jìn)行非均相體系擴(kuò)增。但是，線性單鏈DNA需與鎖狀引物進(jìn)行連接反應(yīng)后再開(kāi)始擴(kuò)增反應(yīng)，這決定了RCA容易受到復(fù)雜溶液體系的干擾，所以RCA在均相體系中的檢測(cè)效果不如非均相體系[28]。

圖4 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)原理示意圖Fig.4 Principle of strand displacement amplification

2.3 鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)

SDA是一種通過(guò)建立循環(huán)置換機(jī)制實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增特定核酸序列的方法，與LAMP相比，SDA對(duì)反應(yīng)溫度要求低，在室溫條件下也能進(jìn)行(圖4)。SDA通常產(chǎn)生較短的DNA單鏈，與嵌入型熒光染料、Tagman探針或分子信標(biāo)(Molecular beacon，MB)等結(jié)合，在擴(kuò)增目標(biāo)序列的同時(shí)放大檢測(cè)信號(hào)，為定量檢測(cè)提供基礎(chǔ)。SDA單鏈的產(chǎn)生可以由具有3端至5端外切酶活性的DNA聚合酶引發(fā)[29]，也可以由基于熱力學(xué)穩(wěn)定性的Toehold置換引發(fā)[30-31]。由于產(chǎn)物為單鏈DNA，具備識(shí)別其他核酸序列的能力，因此SDA也是實(shí)現(xiàn)DNA邏輯運(yùn)算的常用手段[32]。通常情況下，SDA中的靶標(biāo)在啟動(dòng)一次置換反應(yīng)后，無(wú)法被回收，因而只能實(shí)現(xiàn)線性擴(kuò)增，但在切口酶(Nicking enzyme)幫助下，也可實(shí)現(xiàn)指數(shù)級(jí)的快速擴(kuò)增[33]。Tan等[34]將兩段與目標(biāo)序列互補(bǔ)的DNA通過(guò)切口酶的結(jié)合序列串聯(lián)起來(lái)，以堿基配對(duì)原則與目標(biāo)序列結(jié)合，在聚合酶作用下形成平末端DNA雙鏈后，切口酶結(jié)合到新形成的雙鏈識(shí)別原件上，此時(shí)可剪開(kāi)一個(gè)缺口，釋放剛合成的單鏈(目標(biāo)序列)，用于下一輪循環(huán)；與此同時(shí)，被切口酶切割的雙鏈結(jié)構(gòu)可在聚合酶作用下重新形成目標(biāo)序列，達(dá)到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增效果。然而，指數(shù)級(jí)SDA需要多個(gè)DNA結(jié)構(gòu)單元配合，體系較為復(fù)雜，容易受到干擾；SDA反應(yīng)的觸發(fā)需要DNA單鏈，無(wú)法直接對(duì)雙鏈DNA擴(kuò)增。這些缺點(diǎn)限制了SDA的大范圍應(yīng)用，目前尚無(wú)基于SDA的商業(yè)化檢測(cè)產(chǎn)品。

圖5 切口酶擴(kuò)增技術(shù)(NESA)原理示意圖Fig.5 Principle of nicking enzyme signal amplification

圖6 核酸外切酶擴(kuò)增技術(shù)原理示意圖Fig.6 Principle of exonuclease Ⅲ assisted amplification

2.4 切口酶信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)(NESA)

切口酶(Nicking enzyme)與限制性內(nèi)切酶相似，能夠識(shí)別特異的核酸序列，但切口酶只催化一條鏈的磷酸二酯鍵斷裂。切口酶的這一特性主要用于均相檢測(cè)中核酸靶標(biāo)的回收以及信號(hào)的產(chǎn)生。切口酶介導(dǎo)的擴(kuò)增體系由靶標(biāo)識(shí)別元件、信號(hào)產(chǎn)生元件、切口酶識(shí)別序列組成，通過(guò)切口酶切割信號(hào)探針并回收靶標(biāo)用于下一輪信號(hào)產(chǎn)生(圖5)。Li等[35]設(shè)計(jì)了一種特殊的分子信標(biāo)，信標(biāo)的環(huán)形部分堿基序列與需要檢測(cè)的目標(biāo)序列互補(bǔ)，并且其中含有切口酶的識(shí)別序列。信標(biāo)與目標(biāo)序列互補(bǔ)后產(chǎn)生的雙鏈結(jié)構(gòu)，在熱力學(xué)穩(wěn)定性上要高于分子信標(biāo)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因此，當(dāng)目標(biāo)序列出現(xiàn)在檢測(cè)體系中時(shí)，會(huì)使分子信標(biāo)的構(gòu)象發(fā)生改變，打開(kāi)原來(lái)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，形成新的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，進(jìn)而被切口酶切割。切割后，雙鏈之間的氫鍵數(shù)目顯著減少，穩(wěn)定性大大降低，在55 ℃的條件下會(huì)自動(dòng)解離，釋放目標(biāo)序列，用于結(jié)合下一個(gè)分子信標(biāo)，形成擴(kuò)增循環(huán)。目前已經(jīng)有采用類(lèi)似策略檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenteritidis)16S rRNA序列的報(bào)道[36]。切口酶等溫?cái)U(kuò)增方法的最大困難在于酶切識(shí)別位點(diǎn)的引入。通常情況下，核酸靶標(biāo)中不含有識(shí)別序列，需要結(jié)合其他策略來(lái)生成，這限制了NESA的應(yīng)用[37]。NESA更適合作為SDA的輔助單元，配合進(jìn)行信號(hào)的二次放大[38]。

2.5 核酸外切酶Ⅲ輔助擴(kuò)增技術(shù)

除了切口酶，核酸外切酶Ⅲ(Exonuclease Ⅲ)也能通過(guò)類(lèi)似的策略，達(dá)到持續(xù)放大信號(hào)的目的[39]。核酸外切酶Ⅲ具有3端到5端脫氧核糖核酸外切酶活性，與切口酶相比，核酸外切酶不需要特定的識(shí)別序列即可工作，并且只作用于DNA雙鏈的平末端或者3端方向凹陷的粘性末端，因此適用面更廣(圖6)。Zuo等[40]對(duì)常規(guī)的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)做了些許調(diào)整，在3端猝滅基團(tuán)后增加了若干堿基，形成凸出型的3端粘性末端，以避免信標(biāo)本身被核酸外切酶Ⅲ降解。當(dāng)信標(biāo)結(jié)合目標(biāo)DNA序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，3端變?yōu)槠侥┒祟?lèi)型，堿基逐個(gè)被核酸外切酶剝離，熒光基團(tuán)也因?yàn)殁缁鶊F(tuán)的遠(yuǎn)離而發(fā)光。當(dāng)剩余的堿基數(shù)量不足以維持穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，5端含有熒光基團(tuán)的短鏈解離，釋放目標(biāo)序列進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)。Luo等[41]將捕獲探針固定在電極表面，利用核酸外切酶Ⅲ持續(xù)地降解與目標(biāo)結(jié)合的捕獲探針，使得電極表面的DNA數(shù)量持續(xù)減少，導(dǎo)電性增加，據(jù)此來(lái)檢測(cè)常見(jiàn)的腸道細(xì)菌特征DNA序列。核酸外切酶Ⅲ只識(shí)別粘性末端類(lèi)型而不區(qū)分DNA序列的特點(diǎn)，便于在非均相體系中同時(shí)降解不同序列的DNA雙鏈，所以主要用于固相材料捕獲靶標(biāo)DNA后信號(hào)的產(chǎn)生。特別當(dāng)與石墨烯等納米材料結(jié)合時(shí)，核酸外切酶Ⅲ可以快速釋放熒光基團(tuán)，從而解除石墨烯對(duì)熒光的猝滅效應(yīng)，產(chǎn)生信號(hào)[42]。但是，經(jīng)核酸外切酶Ⅲ降解后的單鏈DNA分解為單個(gè)游離核苷酸，無(wú)法進(jìn)行回收，因此難以實(shí)現(xiàn)循環(huán)，一般只能實(shí)現(xiàn)信號(hào)的線性擴(kuò)增。

3 等溫?cái)U(kuò)增存在的共性問(wèn)題

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在近十多年間的發(fā)展非常迅速，LAMP、RCA、NESA、SDA等核酸高效擴(kuò)增方法的出現(xiàn)，有效地縮短了檢測(cè)所需時(shí)間，也降低了對(duì)復(fù)雜檢測(cè)設(shè)備的依賴，為致病微生物的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)提供了良好的基礎(chǔ)。目前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已經(jīng)成為致病微生物快速檢測(cè)的重要方法之一，常見(jiàn)的食源性致病菌，均有眾多成熟的等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法報(bào)道，以及基于等溫?cái)U(kuò)增原理開(kāi)發(fā)的商業(yè)化試劑盒[43-46]。但隨著人們對(duì)食品安全問(wèn)題關(guān)注程度的逐漸提高，以及政府部門(mén)監(jiān)管力度的逐漸加強(qiáng)，致病菌檢測(cè)的需求急劇增長(zhǎng)，并且出現(xiàn)了不少新變化和新問(wèn)題。對(duì)此，等溫?cái)U(kuò)增方法還需要在一些共性問(wèn)題上加以改進(jìn)，以適應(yīng)這些實(shí)際需求。

3.1 活性識(shí)別

等溫?cái)U(kuò)增所檢測(cè)的物質(zhì)是致病菌DNA，其性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，細(xì)菌死亡后DNA不會(huì)立即降解，因此仍可以被擴(kuò)增手段檢測(cè)到。嚴(yán)格意義上來(lái)說(shuō)，等溫?cái)U(kuò)增所得到的結(jié)果，只能證明樣品中細(xì)菌DNA的存在，而無(wú)法獲知細(xì)胞的生存狀態(tài)，這可能導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌危害風(fēng)險(xiǎn)的誤判。

3.2 非特異性擴(kuò)增

快速是等溫?cái)U(kuò)增的關(guān)鍵特點(diǎn)，也是實(shí)現(xiàn)其高靈敏度的重要原因。然而，短時(shí)間內(nèi)對(duì)目標(biāo)基因的高速率復(fù)制，在顯著提升方法靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，也大大增加了等溫?cái)U(kuò)增對(duì)于非靶標(biāo)DNA的敏感性，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增概率上升，產(chǎn)生假陽(yáng)性。例如，在LAMP操作過(guò)程中，只要反應(yīng)體系與外界空氣有過(guò)短暫接觸，就非常容易受到氣溶膠污染，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物中含有大量的非目標(biāo)基因片段。

3.3 前處理步驟

復(fù)雜的溶液成分會(huì)影響氫鍵的穩(wěn)定性，從而降低引物對(duì)靶基因的識(shí)別效率。因此，樣品的前處理對(duì)于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來(lái)說(shuō)非常關(guān)鍵。細(xì)菌DNA必須經(jīng)過(guò)富集、提取和純化，減弱其他因素的干擾，才能被高效識(shí)別和擴(kuò)增，否則將會(huì)引起背景值偏高或信號(hào)值減弱，導(dǎo)致信噪比降低。由于前處理主要依賴人工操作，在某些情況下，前處理所消耗的時(shí)間已經(jīng)超過(guò)了等溫?cái)U(kuò)增所需時(shí)間，成為等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)一步快速化的制約因素[47]。

3.4 檢測(cè)通量

為了進(jìn)一步提高等溫?cái)U(kuò)增的效率，更好地適應(yīng)現(xiàn)場(chǎng)或在線檢測(cè)，不少研究都致力于在單個(gè)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)多個(gè)核酸靶標(biāo)的檢測(cè)，即多重等溫?cái)U(kuò)增策略[48](圖7)。但是，單純通過(guò)增加多組引物達(dá)到同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的方式具有較大局限性。增加引物組數(shù)必然導(dǎo)致體系的復(fù)雜化，不同組引物之間存在交叉組合的可能，增加了獲得非特異性條帶的幾率。目前，多重等溫?cái)U(kuò)增策略能同時(shí)檢測(cè)的靶標(biāo)一般為2到3種，3種以上的多重反應(yīng)往往由于引物組之間的干擾導(dǎo)致靈敏度不佳。

3.5 解決措施

在細(xì)菌活性區(qū)分問(wèn)題上，研究發(fā)現(xiàn)，提取DNA前用疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide，PMA)處理細(xì)菌，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的選擇性擴(kuò)增。死亡細(xì)菌通常會(huì)喪失對(duì)細(xì)胞壁通透性的調(diào)控能力，使得PMA可以自由通過(guò)，并結(jié)合死亡細(xì)菌核區(qū)內(nèi)的基因組DNA，阻止其被DNA聚合酶結(jié)合[13]?；诖嗽恚R骉等[49]構(gòu)建了PMA-LAMP方法，成功區(qū)分了樣品中死亡的和具有活性的副溶血弧菌。但是，在某些情況下，細(xì)胞壁的通透性并不能實(shí)時(shí)反映細(xì)菌的活性，此時(shí)PMA并不能很好地發(fā)揮區(qū)分活性的作用[50]。

在非特異性擴(kuò)增問(wèn)題上，張明洲等[51]優(yōu)化了鈣黃綠素、氯化錳配比及反應(yīng)液鎂離子濃度，降低了染料對(duì)于酶擴(kuò)增效率的影響，從而省略了擴(kuò)增完成后加入染料的步驟，使得污染幾率顯著降低。也有研究者從LAMP產(chǎn)物的識(shí)別角度出發(fā)，利用分子信標(biāo)的特異性識(shí)別功能，只對(duì)目標(biāo)序列產(chǎn)生信號(hào)[52]，雖然在一定程度上降低了假陽(yáng)性率，但是污染引發(fā)的非特異性擴(kuò)增依然存在，并且會(huì)對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增效率產(chǎn)生影響。

在前處理問(wèn)題上，高通量的前處理裝置已經(jīng)逐步用于食品樣品的快速檢測(cè)，例如基于納米級(jí)中空纖維膜的農(nóng)獸藥高通量萃取裝置[53]。細(xì)菌核酸提取的高通量、自動(dòng)化前處理方法和處理裝置的研究也有不少報(bào)道，這有助于進(jìn)一步縮短等溫?cái)U(kuò)增的檢測(cè)時(shí)間，減少人工操作步驟，是等溫?cái)U(kuò)增規(guī)?；瘷z測(cè)的重要基礎(chǔ)[54]。

在檢測(cè)通量問(wèn)題上，伴隨著等溫?cái)U(kuò)增芯片化的研究趨勢(shì)(圖7)，等溫?cái)U(kuò)增的體系得以不斷縮小，單位面積可容納的獨(dú)立反應(yīng)個(gè)數(shù)得到增加，這為解決檢測(cè)通量問(wèn)題提供了新的角度。Zhou等[55]設(shè)計(jì)了基于離心作用的LAMP微流控芯片，通過(guò)在圓盤(pán)形平面上構(gòu)建獨(dú)立反應(yīng)通道來(lái)增加通量，可以同時(shí)檢測(cè)10種常見(jiàn)的食源性致病菌。

4 結(jié) 論

綜上所述，雖然等溫?cái)U(kuò)增已有將近20年的歷史，但因其準(zhǔn)確性高、檢測(cè)用時(shí)短、便攜易操作的特點(diǎn)。目前依然作為快速檢測(cè)和在線檢測(cè)的主要手段被廣泛應(yīng)用于食源性致病微生物的檢驗(yàn)檢疫中。以LAMP和NEAR為代表的商業(yè)化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)產(chǎn)品的成功，也證明了等溫?cái)U(kuò)增在微生物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的價(jià)值。等溫?cái)U(kuò)增的相關(guān)研究持續(xù)受到較高的關(guān)注，其技術(shù)缺陷也正在被逐步克服，芯片化、高通量的等溫?cái)U(kuò)增方法及其裝置正在逐漸成為熱點(diǎn)，隨著技術(shù)體系的不斷完善，其應(yīng)用前景將會(huì)更加廣闊。