γ-氨基丁酸鍵合硅膠毛細(xì)管色譜柱填料的綠色制備及其分析性能研究

趙雙麗，羅菲菲，祝璐琪，王清江，何品剛

(華東師范大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200241)

色譜柱是色譜分離的核心，對填充毛細(xì)管色譜柱來說，色譜填料直接影響其對分析物的選擇性和分離效率。目前，色譜固定相大多以多孔二氧化硅為基質(zhì)進(jìn)行表面化學(xué)修飾制備而成[1]，根據(jù)所鍵合官能團的不同具有不同的色譜分離機制，進(jìn)而為分離復(fù)雜樣品提供多種選擇。在以往研究中，合成色譜固定相所用溶劑往往是易揮發(fā)、有毒的有機溶劑(如甲苯[2-4]、甲醇[5-6]、氯仿[7-8]和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)[9-10]等)，但近年來隨著環(huán)境問題越來越受到人們的關(guān)注，亟待建立不涉及有毒有害溶劑的“綠色化學(xué)”合成技術(shù)[11-12]。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的活性物質(zhì)[13]，其結(jié)構(gòu)中所含氨基、羧基等極性基團具有親水作用；此外，GABA是一種兩性物質(zhì)，還具有離子交換作用。本文在不含任何有機溶劑的水相條件下，通過一步反應(yīng)綠色制備了GABA修飾的硅膠固定相(Sil-GABA)，并將其用于不同類型分析物的色譜分離，結(jié)果表明，Sil-GABA固定相具有多種色譜分離模式的作用機理：在富水模式下可分離硝基氯苯位置異構(gòu)體和7種磺胺，親水模式下可分離4種苯甲酸類化合物，反相模式下可分離硝基苯胺位置異構(gòu)體。目前尚未見SiO2表面鍵合GABA的色譜固定相報道。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

Trisep-2100加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)儀器(上海通微分析技術(shù)有限公司)，配有紫外檢測器；2400 Ⅱ元素分析儀(美國Perkin Elmer公司)；Nicolet NEXUS 670傅立葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；高壓輸液泵(北京萊伯秦科儀器股份有限公司)。

1.2 Sil-GABA固定相的制備

硅膠在使用前需經(jīng)活化處理[14]：稱取一定質(zhì)量硅膠均勻分散于10%的稀鹽酸中，置于圓底燒瓶中回流加熱30 min；冷卻至室溫，過濾懸浮液，超純水洗滌至流出液呈中性；將過濾后的硅膠于180 ℃真空干燥4 h。

Sil-GABA的制備過程見圖1。首先通過堿性條件下的開環(huán)反應(yīng)實現(xiàn)GABA與硅烷化試劑的鍵合，然后再修飾到硅膠表面。具體步驟如下：稱取0.01 g的GABA溶于20 mL超純水中，用Na2CO3溶液調(diào)至pH 10.6，再滴加22 μL的GPS，混合液于冰水浴下以230 r/min磁力攪拌2 h；再采用CH3COOH調(diào)節(jié)反應(yīng)后的溶液至pH 6.0后轉(zhuǎn)移至含有0.5 g活化硅膠的圓底燒瓶中，于100 ℃下回流2 h。最后，過濾反應(yīng)懸浮液，用超純水洗滌濾餅，并于70 ℃真空干燥6 h，即制得Sil-GABA固定相。

圖1 Sil-GABA固定相的合成Fig.1 Synthesis of the Sil-GABA stationary phase

圖2 Sil-GABA的填充示意圖Fig.2 Schematic diagram of the Sil-GABA packing procedure1:preparation of a temporary frit;2,3:packing the capillary with the Sil-GABA;4:preparation of the permanent frits at both ends;5:elimination of the excess of packings;6:preparation of a detection window

1.3 毛細(xì)管柱的裝填

截取50 cm石英毛細(xì)管，用1 mol/L NaOH處理0.5 h，再用超純水洗滌至流出液呈中性；然后用0.1 mol/L HCl處理0.5 h，再用超純水洗滌至流出液呈中性。將處理后的石英毛細(xì)管用于Sil-GABA固定相的裝填(圖2)，毛細(xì)管一端吸取飽和硅酸鈉溶液，于燒紅的電爐絲上加熱1～2 s，制得臨時柱塞；另一端連接到裝有固定相懸浮液(0.2 g Sil-GABA均勻分散于乙腈中)的不銹鋼管中。以80%的甲醇為頂替液，在20 MPa的壓力下將Sil-GABA填料填入毛細(xì)管中(為使填料更均勻致密，在整個裝填過程中毛細(xì)管需置于超聲浴中)。在距離臨時柱塞約24 cm處，通過電爐絲加熱Sil-GABA填料制得另一端柱塞，即永久柱塞(用同樣的方法去除臨時柱塞)。撤掉液相色譜泵的壓力，取下毛細(xì)管，反向連接，在10 MPa的壓力下去除多余的填料。最后，在靠近出口端柱塞處，通過去除毛細(xì)管外層涂料，制得1～2 mm左右的檢測窗口。

1.4 色譜條件

實驗所用石英毛細(xì)管色譜柱外徑360 μm，內(nèi)徑100 μm，總長50 cm；Sil-GABA 固定相有效填充長度為24 cm；流動相所用溶劑為色譜純的甲醇、乙腈；流動相流速0.02 mL/min；檢測波長為254 nm；溶解樣品所用溶劑均為甲醇、超純水。

圖3 硅膠和Sil-GABA的紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of silica and Sil-GABAa.SiO2,b.Sil-GABA

2 結(jié)果與討論

2.1 固定相的表征

固定相中各元素含量的分析結(jié)果表明：活化SiO2中C含量為0.294%，H為0.784%，未檢出N；而Sil-GABA中C含量為3.888%，H為1.116%，N為0.345%。與未修飾的SiO2相比，制備的固定相中C、H含量明顯增加，且在其表面檢出N元素，進(jìn)一步表明已成功制備了Sil-GABA。由元素分析中N含量計算得GABA在SiO2表面的覆蓋程度為0.87 μmol/m2。

2.2 Sil-GABA作用機理及色譜性能評價

2.2.1 富水模式色譜富水模式色譜流動相中水占有很高的比例(70%～100%)，可減少有機溶劑的使用[15]。作為一種綠色色譜分析方法，富水模式色譜可替代親水色譜用于一些極性物質(zhì)的分離。本研究通過對硝基氯苯位置異構(gòu)體和磺胺類物質(zhì)的色譜分離，研究Sil-GABA固定相在富水模式下的分離特性。

(1)硝基氯苯位置異構(gòu)體的分離：硝基氯苯具有一定的極性，其位置異構(gòu)體的分離色譜圖見圖4，流動相采用20 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈。結(jié)果顯示，流動相中20 mmol/L乙酸銨水溶液與乙腈的體積比為80∶20時，異構(gòu)體的保留時間相同，色譜峰重疊；當(dāng)20 mmol/L乙酸銨的體積分?jǐn)?shù)由80%增至90%時，流動相極性增強，保留時間增加；繼續(xù)升高20 mmol/L乙酸銨水溶液的體積分?jǐn)?shù)為100%時，鄰、間、對硝基氯苯在25 min內(nèi)可實現(xiàn)基線分離，保留因子分別為0.145、0.456、0.754，分離度分別為3.2、1.56。表明Sil-GABA固定相對硝基氯苯具有良好的選擇性，在富水色譜模式下可用于硝基氯苯位置異構(gòu)體的分離。

圖4 硝基氯苯位置異構(gòu)體的分離色譜圖Fig.4 Chromatograms of nitrochlorobenzene isomersA,B,C:ammonium acetate-acetonitrile was 80∶20,90∶10,100∶0(by volume);1.m-nitrochlorobenzene,2.o-nitrochlorobenzene,3.p-nitrochlorobenzene

圖5 7種磺胺的分離色譜圖Fig.5 Chromatograms of seven sulfonamidesmobile phase:20 mmol/L ammonium acetate(pH 4.0);1.SG,2.SD,3.SM1,4.SM2,5.SMZ,6.SDM,7.SQ

圖6 4種苯甲酸類化合物的分離色譜圖Fig.6 Chromatograms of four benzoic acid compoundsmobile phase:20 mmol/L ammonium acetate,A,B,C:water-acetonitrile was 40∶60,30∶70,20∶80(by volume);1.2,3-dihydroxybenzoic acid,2.benzoic acid,3.3,4-dihydroxybenzoic acid,4.4-hydroxybenzoic acid

(2)磺胺類藥物的分離：以7種磺胺(SG、SD、SM1、SM2、SMZ、SDM、SQ)為分離對象，20 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相探討了在富水色譜模式下的分離條件。由于GABA是一種兩性離子化合物，流動相pH值和濃度會影響分析物在固定相上的保留情況，因此實驗考察了pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、8.0時7種磺胺的保留情況。結(jié)果表明，隨著pH值增大，SG的保留時間基本不變，但其余6種磺胺在Sil-GABA固定相上的保留時間都有所增加。這是因為GABA的等電點為7.19，隨著流動相pH值的增加，越來越多的GABA會以負(fù)離子形式存在，固定相與磺胺的相互作用增強，造成保留時間延長。另外，乙酸銨的濃度也會改變?nèi)軇┑碾x子強度，進(jìn)而影響分析物在固定相上的峰形和分離效率[16]。因此實驗還考察了乙酸銨濃度分別為10、20、40、50、100 mmol/L時對磺胺保留的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙酸銨濃度的增加，7種磺胺在Sil-GABA固定相上的保留減弱，這是因為溶液離子強度增加，縮短了保留時間。

在流動相為20 mmol/L乙酸銨(pH 4.0)的條件下，除SM2、SMZ外，其余5種磺胺都實現(xiàn)了良好的分離(圖5)。

2.2.2 親水模式色譜在高親水性有機溶劑乙腈為流動相的條件下，考察了4-羥基苯甲酸、3,4-二羥基苯甲酸、2,3-二羥基苯甲酸、苯甲酸在Sil-GABA固定相上的保留特征(圖6)。結(jié)果顯示，隨著流動相中乙腈含量的增加，上述化合物保留增強，分離度增大，與親水模式色譜的保留機理一致。當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)增至80%時，4種苯甲酸類化合物實現(xiàn)了良好的分離，出峰順序依次為2,3-二羥基苯甲酸(pKa=2.96)、苯甲酸(pKa=4.20)、3,4-二羥基苯甲酸(pKa=4.45)、4-羥基苯甲酸(pKa=4.57)，與其pKa值由小到大的順序一致。這是因為鍵合GABA后硅膠表面的羧基具有弱陽離子交換作用，離子交換是其完成色譜分離的主要機制。

2.2.3 反相模式色譜以甲醇-水為流動相，以硝基苯胺位置異構(gòu)體為分離對象，探究Sil-GABA固定相的反相色譜模式，鄰、間、對位硝基苯胺的色譜分離圖見圖7。流動相中甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%時，鄰、對硝基苯胺的色譜峰重疊，當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)由20%降至10%時，從色譜圖上可以觀察到鄰硝基苯胺的色譜峰；當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)降至5%時，各分析物的保留增強，3個異構(gòu)體之間的分離度增加，可在20 min內(nèi)實現(xiàn)分離，保留因子分別為0.966、1.228、1.448，分離度分別為2.15、1.60。由此可見，Sil-GABA具有反相色譜的保留特性。但色譜峰出峰順序為間位(LgP=1.338)、對位(LgP=1.195)、鄰位(LgP=1.669)，與疏水性順序不一致，表明Sil-GABA存在多種保留機理。

2.3 重復(fù)性試驗

以磺胺類藥物為分析物，考察了該色譜柱的重復(fù)性，實驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，7種磺胺保留時間的日內(nèi)和日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.42%～1.3%、0.49%～3.2%。在整個分析測試期間，重復(fù)進(jìn)樣色譜峰的峰形和分離效率均無明顯變化，表明此毛細(xì)管填充柱具有良好的分析重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表1 磺胺的重復(fù)性試驗Table 1 Repeatability test of seven sulfonamides

3 結(jié) 論

本文在水相溶劑中綠色制備了Sil-GABA色譜填料，采用紅外光譜、元素分析對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，發(fā)現(xiàn)該填料具有多種保留機理，可用于磺胺、硝基氯苯位置異構(gòu)體、苯甲酸類化合物和硝基苯胺位置異構(gòu)體的分離，且具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。該Sil-GABA填料制備方法簡單、綠色無毒，作為色譜填料在毛細(xì)管液相色譜中有潛在的應(yīng)用價值。