固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定植物性食品中鏈霉素與雙氫鏈霉素

李敏青，徐 娟*，王 嵐，安文佳，孫靈慧，何曼莉

(1.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510623；2.廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623)

鏈霉素、雙氫鏈霉素是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，雙氫鏈霉素是將鏈霉素中鏈霉糖部分的醛基氫化后所獲得的另一種鏈霉素衍生物，與鏈霉素有相似的功效。兩者常被用于治療細(xì)菌性感染，是防治果樹火燒病的植物保護(hù)劑，可有效防治植物細(xì)菌病害，如蘋果和梨的火疫病、黃瓜角斑病、菜豆霜霉病、芹菜細(xì)菌性疫病[1]。其作用機(jī)制為通過抑制肽鏈延長(zhǎng)阻礙細(xì)菌合成蛋白質(zhì)并致其死亡。但兩者具有嚴(yán)重的耳毒性及腎毒性且易引發(fā)過敏反應(yīng)，歐盟、美國(guó)、日本和中國(guó)香港等國(guó)家和地區(qū)均規(guī)定了其最大殘留限量[2]。其中，中國(guó)《GB 2763-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》和歐盟標(biāo)準(zhǔn)對(duì)植物性食品中鏈霉素、雙氫鏈霉素不作最大殘留限量要求，而日本肯定列表和新西蘭最大殘留限量法則規(guī)定植物性食品計(jì)算鏈霉素殘留量時(shí)應(yīng)將雙氫鏈霉素一同計(jì)入，因此在殘留檢測(cè)中應(yīng)同時(shí)檢測(cè)二者[3]。另外，中國(guó)香港《食物內(nèi)殘余除害劑規(guī)例》和美國(guó)最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)仁果類水果、土豆、芹菜、番茄、(甜)辣椒、干扁豆、紅豆中鏈霉素或雙氫鏈霉素的限量要求為0.25～0.50 mg/kg[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢測(cè)方法主要有微生物法[5]、免疫分析法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7]、液相色譜法[8-9]和液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[10-15]等。其中LC-MS/MS技術(shù)兼具靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于鏈霉素和雙氫鏈霉素藥物的分析，并取得了很好的效果，逐漸成為鏈霉素和雙氫鏈霉素藥物殘留確證分析的主要方法。我國(guó)現(xiàn)行的檢測(cè)鏈霉素和雙氫鏈霉素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及現(xiàn)有文獻(xiàn)所涉及基質(zhì)多為蜂王漿、奶制品、水產(chǎn)品、飼料、肉制品以及番茄制品、花粉等[16-20]，尚未見蔬菜、水果以及糧谷中鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢驗(yàn)方法或標(biāo)準(zhǔn)?；诖耍疚牟捎酶咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了一種適用于多種蔬果及糧谷樣品中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留的檢測(cè)方法，以期為該藥劑在植物生態(tài)系統(tǒng)中的合理安全用藥提供技術(shù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantiva液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配備電噴霧電離源(ESI)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Milli-Q高純水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)；XP205分析天平(感量0.01 g和0.000 1 g，瑞士Mettler公司)；MiltiReax型渦旋振蕩器(德國(guó)Heidolph公司)；Promax-2020型水平往復(fù)振蕩器(德國(guó)Heidolph公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；甲酸銨(色譜純，上海CNW公司)；十二水合磷酸氫二鈉、磷酸、乙酸(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；WCX固相萃取柱(60 mg，Waters公司)；鏈霉素、雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度≥98.0%，Dr.Ehrenstorfer公司)；有機(jī)微孔濾膜(0.22 μm，津騰公司)；實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取適量鏈霉素、雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品，用水配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0～4 ℃避光保存。準(zhǔn)確移取一定體積的鏈霉素、雙氫鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水稀釋配成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件Atlantis Hilic Silica色譜柱(100 mm×3.0 mm,3 μm)；柱溫:40 ℃；進(jìn)樣量:5 μL；流速:0.3 mL/min；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1 mol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)溶液(B)(體積比1∶1)，等度洗脫8 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；電噴霧電壓：3 500 V；鞘氣(氮?dú)猓兌?99.99%)：40 Arb，輔助氣(氮?dú)?，純?99.99%)：8 Arb，吹掃氣(氮?dú)猓兌?99.99%)：1 Arb；離子源溫度(TEM)：350 ℃；傳輸管溫度(TEM)：350 ℃。鏈霉素和雙氫鏈霉素的保留時(shí)間、母離子和碎片離子、碰撞能量以及去簇電壓參數(shù)見表1。

表1 鏈霉素和雙氫鏈霉素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of streptomycin and dihydrostreptomycin

*quantitation ion

1.4 樣品前處理

1.4.1 提 取稱取約5.0 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL具塞塑料離心管中，蔬果樣品加入12 mL提取溶劑(0.02 mol/L磷酸氫二鈉溶液，用磷酸調(diào)至pH 7.0)，振蕩提取10 min，以4 500 r/min離心5 min，收集提取液于25 mL塑料容量瓶中，殘?jiān)偌尤?0 mL提取溶劑重復(fù)提取一次，合并提取液并用提取溶劑定容至25 mL，待凈化；豆類(干)樣品加入25 mL提取溶劑，振蕩提取10 min，以4 500 r/min離心5 min，待凈化。

1.4.2 凈 化將弱陽(yáng)離子交換柱WCX依次用3 mL甲醇、3 mL水活化后，移取上述5 mL樣液上柱，依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，棄去所有流出液，再用4 mL乙腈-2%乙酸溶液(體積比1∶4)洗脫，收集洗脫液并定容至5 mL，渦旋混勻，吸取1.5 mL溶液于微型高速離心管中，以12 000 r/min離心5 min，取上清液過濾膜至進(jìn)樣瓶中，供LC-MS/MS分析測(cè)定。

1.4.3 基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備稱取5份約5 g(精確至0.01 g)陰性試樣于50 mL具塞塑料離心管中，分別加入不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，余下操作同“1.4.1”和“1.4.2”所述，得到最終的定容質(zhì)量濃度分別為10、25、50、100、120 μg/L的基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇由于鏈霉素和雙氫鏈霉素是強(qiáng)極性物質(zhì)，易溶于水，難溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，常用的提取試劑有磷酸溶液和磷酸鹽緩沖溶液。因此，實(shí)驗(yàn)考察了水、稀磷酸溶液(pH 1.96)、磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)以及磷酸鹽緩沖液+庚烷磺酸鈉(0.025 mol/L磷酸鈉+0.05 mol/L庚烷磺酸鈉) 4種溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用水和稀磷酸進(jìn)行提取時(shí)的回收率較低(小于40%)，且目標(biāo)物的峰形和靈敏度均不理想；而磷酸鹽緩沖溶液對(duì)樣品的酸堿性有一定緩沖作用，用磷酸調(diào)至pH 7.0時(shí)，能保持鏈霉素和雙氫鏈霉素以穩(wěn)定陽(yáng)離子狀態(tài)存在，有利于后續(xù)SPE柱凈化時(shí)的離子交換。結(jié)果顯示，磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素的提取效率更高，而磷酸鹽緩沖溶液添加庚烷磺酸鈉后對(duì)目標(biāo)化合物的回收并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)，因此，本文選擇磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)作為提取溶劑。

2.1.2 提取方式的選擇目前食品檢測(cè)中常用的提取方法有勻漿提取、渦旋提取、超聲提取、振蕩提取、強(qiáng)化溶劑萃取等，基于本方法的檢測(cè)對(duì)象為蘋果、土豆、芹菜、番茄、(甜)辣椒、干扁豆，且綜合考慮操作時(shí)間，采用添加回收實(shí)驗(yàn)分別對(duì)超聲提取和振蕩提取進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，對(duì)樣品進(jìn)行批量處理時(shí)，超聲提取的樣品回收率穩(wěn)定性較差，這可能是超聲過程中的水溫未能持續(xù)保持在常溫下所致，因此本實(shí)驗(yàn)選擇振蕩提取。

2.1.3 凈化小柱的選擇已有文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)鏈霉素和雙氫鏈霉素時(shí)多采用反相C18柱、離子交換柱或反相固相萃取柱串聯(lián)離子交換柱凈化，因此，本實(shí)驗(yàn)考察了C18柱、MCX(強(qiáng)陽(yáng)離子交換)柱、WCX(弱陽(yáng)離子交換)柱以及反相固相萃取柱串聯(lián)WCX柱的凈化效果。4種SPE柱均依次加入甲醇、水進(jìn)行活化后，移取樣液上柱，對(duì)于MCX柱、WCX柱和HLB串聯(lián)WCX柱依次加入水和甲醇進(jìn)行淋洗，C18柱則依次加入水和叔丁基甲基醚-正己烷(4∶1，體積比)進(jìn)行淋洗，棄去所有流出液，C18柱和MCX柱分別加入甲醇和5%氨水甲醇進(jìn)行洗脫，而WCX柱和HLB串聯(lián)WCX柱則加入2%甲酸甲醇進(jìn)行洗脫，收集濾液并定容，供LC-MS/MS分析測(cè)定。結(jié)果顯示，WCX柱比C18柱、MCX柱對(duì)目標(biāo)分析物的選擇性更強(qiáng)，保留能力更佳，回收率及凈化效果更好。另外，比較了單一WCX柱和采用反相固相萃取柱串聯(lián)WCX柱兩種凈化方式，發(fā)現(xiàn)兩者的回收率和凈化效果相差不大，均能滿足凈化要求。相比于雙柱凈化，單柱凈化簡(jiǎn)化了操作步驟，節(jié)省了分析時(shí)間及大量溶劑，具有簡(jiǎn)單、快速、凈化效果好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，在滿足本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)要求的前提下，并綜合考慮檢測(cè)成本，最終確定WCX柱作為凈化小柱。

2.1.4 洗脫液的選擇WCX(弱陽(yáng)離子交換)柱中待測(cè)物的洗脫常用酸性甲醇溶液，若酸含量太少，不利于待測(cè)物洗脫，而酸的含量太多又可能會(huì)有較多的干擾物被洗脫下來(lái)。因此，實(shí)驗(yàn)考察了2%甲酸甲醇、5%甲酸甲醇、10%甲酸甲醇以及乙腈-2%乙酸溶液(1∶4，體積比) 4種溶劑的洗脫效果。結(jié)果表明，目標(biāo)物回收率未隨溶劑中甲酸含量的升高而提高，4種溶劑洗脫效果相當(dāng)，由于Atlantis Hilic Silica色譜柱在使用時(shí)應(yīng)盡量避免使用甲醇。因此，實(shí)驗(yàn)選用乙腈-2%乙酸溶液進(jìn)行洗脫。

圖1 Atlantis Hilic Silica色譜柱對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素分離的色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 Separation of streptomycin and dihydrostreptomycin by Atlantis Hilic Silica chromatographic column

2.2 色譜-質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇鏈霉素和雙氫鏈霉素屬于堿性化合物，易溶于水，極性強(qiáng)，在傳統(tǒng)的反相色譜柱上幾乎無(wú)保留。已有文獻(xiàn)大多采用離子對(duì)色譜分析方法，即在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑增加被測(cè)化合物的保留以獲得滿意的分離效果，但采用液相色譜-質(zhì)譜法時(shí)，即使離子對(duì)試劑是易揮發(fā)的(如七氟丁酸)依舊難以避免其在質(zhì)譜系統(tǒng)殘留產(chǎn)生離子抑制作用，特別是對(duì)負(fù)離子檢測(cè)模式的影響更加嚴(yán)重，且使用完離子對(duì)試劑后需長(zhǎng)時(shí)間清洗方可使質(zhì)譜儀恢復(fù)正常，在便捷性上具有較大局限。本研究采用Spursil-C18(150 mm×4.6 mm,3 μm)、Inertsil ODS-4(150 mm×2.1 mm,3 μm)以及親水作用的正相硅膠柱Atlantis Hilic Silica(100 mm×3.0 mm,3 μm) 3種色譜柱在各自適用的優(yōu)化色譜條件下對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：鏈霉素在Spursil-C18柱上的峰形很差，且響應(yīng)及靈敏度低；在Inertsil ODS-4色譜柱上幾乎無(wú)保留，約在0.7 min時(shí)即出峰；而在親水作用的正相硅膠柱Atlantis Hilic Silica上的保留較好，出峰時(shí)間約在4.6 min(圖1)，因此選擇Atlantis Hilic Silica色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 流動(dòng)相的選擇由于本研究采用Atlantis Hilic Silica色譜柱進(jìn)行分離，且在正離子模式下檢測(cè)，依據(jù)Waters公司推薦，有機(jī)相常用乙腈溶液，水相一般為乙酸銨或甲酸銨的水溶液、乙酸或甲酸的水溶液，或者鹽和酸同時(shí)使用的水溶液。由于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用中鹽的使用通?？筛纳拼郎y(cè)物的峰形和靈敏度，因此實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度(0.005、0.01、0.1 mol/L)甲酸銨和0.1%甲酸水溶液為水相時(shí)的檢測(cè)效果，發(fā)現(xiàn)甲酸銨濃度為0.1 mol/L時(shí)，待測(cè)物的響應(yīng)比0.01 mol/L時(shí)更高，且峰形更對(duì)稱不拖尾，因此選擇甲酸銨濃度為0.1 mol/L。另外，質(zhì)譜中測(cè)定正離子時(shí)，添加酸有利于提高待測(cè)物的離子化效率，提高檢測(cè)靈敏度。實(shí)驗(yàn)考察了不同甲酸含量(0.1%、0.2%)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，結(jié)果顯示，甲酸含量為0.2%時(shí)，待測(cè)物的峰形拖尾明顯，靈敏度更低，且過多的酸會(huì)損害色譜柱和質(zhì)譜儀。因此，選擇流動(dòng)相為乙腈-0.1 mol/L甲酸銨(含0.1%甲酸)溶液。此外，實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)采用Atlantis Hilic Silica色譜柱進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，如果下一針沒有達(dá)到流動(dòng)相充分平衡，該柱的柱殘留效應(yīng)會(huì)很強(qiáng)，難以獲得良好的重現(xiàn)性，需多次用空白溶液進(jìn)樣方式洗針方能消除上一針殘留，因此，為消除柱殘留效應(yīng)以獲得良好的重現(xiàn)性，流動(dòng)相采用等度洗脫。

2.2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化根據(jù)歐盟(2002/657/EC)指令規(guī)定，質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)應(yīng)在確定母離子的基礎(chǔ)上選擇2個(gè)以上的子離子。通過對(duì)鏈霉素和雙氫鏈霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定其分子離子峰[M+H]+分別為m/z582.2和m/z584.3，再對(duì)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜全掃描，發(fā)現(xiàn)鏈霉素的主要特征碎片為m/z263.0、246.0，雙氫鏈霉素為m/z263.0、246.1。同時(shí)對(duì)碰撞氣能量、毛細(xì)管電壓和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與定量下限本實(shí)驗(yàn)采用陰性蘋果加標(biāo)0.25 mg/kg樣品(重復(fù)6次測(cè)定)分別考察了在標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線、基質(zhì)匹配工作曲線和基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3種曲線下的平均回收率(基質(zhì)匹配工作曲線是指在樣品處理后，最終定容時(shí)加入各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液；基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)工作曲線則是指在樣品稱樣后即加入各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品處理)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，6份樣品以標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線計(jì)算得鏈霉素和雙氫鏈霉素的絕對(duì)平均回收率為33%和36%，以基質(zhì)匹配曲線計(jì)算分別為55%和62%，而以基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算為92.3%和100%。由此可見，植物性食品中的基質(zhì)效應(yīng)非常明顯，并且食品在提取和凈化前處理過程中也存在較大損失，目前由于未能找到合適的內(nèi)標(biāo)物來(lái)校正鏈霉素和雙氫鏈霉素，因此采用基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)溶液考察其標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別配制質(zhì)量濃度為10、25、50、100、120 μg/L的鏈霉素和雙氫鏈霉素基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)工作液(見“1.4.3”所述)，以待測(cè)物峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，鏈霉素和雙氫鏈霉素在蘋果、芹菜、甜椒、干扁豆中的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表2。結(jié)果表明，4種基質(zhì)下的鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性良好(r2≥0.999)。以方法的最低添加水平作為定量下限[21]，得鏈霉素和雙氫鏈霉素定量下限為0.125 mg/kg，低于中國(guó)香港《食物內(nèi)殘余除害劑規(guī)例》的最大殘留限量0.25 mg/kg[4]。

2.3.2 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)以蘋果、芹菜、甜椒、干扁豆為空白樣品基質(zhì)，分別進(jìn)行125、250、500 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度平行實(shí)驗(yàn)6次，在優(yōu)化條件下測(cè)定。結(jié)果顯示，鏈霉素和雙氫鏈霉素在3個(gè)濃度水平下的平均回收率為83.6%～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～7.6%，由此可見，通過基質(zhì)提取標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后均可達(dá)到規(guī)定的回收率要求，能夠滿足鏈霉素和雙氫鏈霉素同時(shí)分析的要求?？瞻滋O果樣品中添加125 μg/kg鏈霉素和雙氫鏈霉素的MRM圖見圖2。

表2 不同植物性食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)Table 2 Regression equations，correlation coefficients，average recoveries and relative standard deviation(RSD,n=6)

圖2 空白蘋果樣品中添加125 μg/kg鏈霉素(A)和雙氫鏈霉素(B)的MRM譜圖

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)采用本方法對(duì)市售蔬菜(芹菜、甜椒和黃瓜)、水果(蘋果、梨和西紅柿)、糧谷(紅豆和扁豆)共30個(gè)樣品進(jìn)行鏈霉素和雙氫鏈霉素的殘留測(cè)定，結(jié)果顯示，在所有樣品中均未檢出鏈霉素及雙氫鏈霉素殘留。

3 結(jié) 論

本研究建立了植物性食品中鏈霉素和雙氫鏈霉素的固相萃取/高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。該方法采用單柱凈化，具有樣品前處理簡(jiǎn)單，線性范圍寬，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。方法采用WCX固相萃取柱富集凈化，乙腈-2%乙酸水溶液洗脫，成本低，效果穩(wěn)定，經(jīng)親水作用HILIC色譜柱分離，能避免離子對(duì)試劑抑制離子化效率，提高靈敏度，有效排除了復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾并滿足目標(biāo)物的定性和定量檢測(cè)要求。