流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法測(cè)定豬飼料中的吡喹酮

羅 瓊，陳復(fù)彬，李青輕，黎 東，楊春艷*

(1.西華師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)合成與污染控制四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637002；2.南充市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 南充 637000)

吡喹酮(Praziquantel)是一種合成的異喹啉—吡嗪衍生物，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其歸納為一種基本藥物[1]，在治療由血吸蟲病引發(fā)的發(fā)育遲緩、消瘦、缺乏體能、認(rèn)知障礙及不孕等疾病中發(fā)揮著重要作用[2]；與此同時(shí)，它還是治療家畜中由各種吸蟲和絳蟲引發(fā)感染的重要藥物[3]。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，吡喹酮卻因其高效和廉價(jià)的特點(diǎn)而被過度濫用，產(chǎn)生了嚴(yán)重的藥物殘留，殘留量甚至超過了“日本肯定列表制度”中對(duì)其規(guī)定的 20 μg/kg 的范圍[4]，給人們的健康帶來了很大危害(如：萎靡不振、頭痛、惡心、腹痛、產(chǎn)生耐藥性等癥狀)[5]。盡管中國尚未對(duì)吡喹酮?dú)埩袅孔龀雒鞔_的規(guī)定，但作為一個(gè)貿(mào)易大國，對(duì)吡喹酮?dú)埩袅康臋z測(cè)是不可或缺的。目前檢測(cè)吡喹酮的方法主要有：液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[6-9]、氣相色譜法(GC)[10]、中紅外光譜法[11]、反相高效液相色譜-紫外法(RP-HPLC-UV)[12]等。盡管這些方法對(duì)吡喹酮的檢測(cè)有一定優(yōu)勢(shì)，但往往需要昂貴的儀器，且檢測(cè)時(shí)間長、操作復(fù)雜，因此尋找一種儀器便宜，并能簡單、快速檢測(cè)吡喹酮的方法至關(guān)重要。而流動(dòng)注射-化學(xué)發(fā)光法(FI-CL)可滿足以上優(yōu)點(diǎn)，此外其還有很高的檢測(cè)靈敏度，在醫(yī)藥[13-15]、環(huán)境[16-17]、食品[18-19]等各個(gè)領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用。

本研究發(fā)現(xiàn)，Luminol與NaIO4能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，而吡喹酮可使其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度顯著降低，且發(fā)光強(qiáng)度與吡喹酮濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，基于此建立了測(cè)定吡喹酮的新方法,并成功運(yùn)用于豬飼料中吡喹酮含量的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RFL-1型超微弱化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光檢測(cè)儀(西安瑞邁分析儀器有限公司)，UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(安捷倫公司)。

Luminol儲(chǔ)備液(1.0×10-2mol/L)：稱取0.177 2 g Luminol，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解后轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，用水定容，避光保存，使用前至少放置24 h，使用時(shí)逐級(jí)稀釋；吡喹酮儲(chǔ)備液(1.0×10-3mol/L)：稱取0.015 6 g吡喹酮用水溶解并定容后，避光保存，使用時(shí)逐級(jí)稀釋；1.0×10-2mol/L的NaIO4儲(chǔ)備液；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

FI-CL流路如圖1所示：蠕動(dòng)泵P1分別輸送Luminol與NaOH溶液，當(dāng)流動(dòng)體系平穩(wěn)，化學(xué)發(fā)光信號(hào)穩(wěn)定時(shí)，獲得基線信號(hào)Io。吡喹酮和NaIO4溶液以及載流H2O通過蠕動(dòng)泵P2輸送，且吡喹酮溶液及載流H2O通過六通閥V進(jìn)樣，反應(yīng)產(chǎn)生的抑制信號(hào)為Is。分別記錄發(fā)光體系的基線信號(hào)(Io)和抑制信號(hào)(Is)，峰高值ΔI=Io-Is。

圖2 魯米諾化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Chemiluminescence kinetic curve of luminol chemical reactionc(Luminol)=4.0×10-4 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=8.0×10-3 mol/L;c(Praziquantel)=2.0×10-7 mol/L

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線及機(jī)理的探究

吡喹酮對(duì)Luminol-NaIO4發(fā)光體系的發(fā)光信號(hào)具有很強(qiáng)的抑制作用，其化學(xué)發(fā)光動(dòng)力學(xué)曲線如圖2。由圖可以看出，未加入吡喹酮時(shí)，反應(yīng)產(chǎn)生較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的速度很快，化學(xué)發(fā)光信號(hào)在反應(yīng)開始后1.9 s達(dá)到峰值，發(fā)光強(qiáng)度為5 329；當(dāng)加入吡喹酮后，發(fā)光強(qiáng)度被抑制，化學(xué)發(fā)光信號(hào)反應(yīng)開始后2.3 s達(dá)到峰值，發(fā)光強(qiáng)度為1 908。因此，無論吡喹酮是否加入Luminol-NaIO4化學(xué)發(fā)光體系中，從化學(xué)反應(yīng)開始至達(dá)到峰值的時(shí)間均很短，這表明該體系是一種快速發(fā)光反應(yīng)，適合于用FI-CL方法檢測(cè)吡喹酮。

為了考察Luminol-NaIO4-Praziquantel可能的反應(yīng)機(jī)理，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：將熒光分光光度計(jì)的光源關(guān)掉，借助流動(dòng)注射技術(shù)分別掃描了Luminol-NaIO4以及含有吡喹酮的Luminol-NaIO4混合溶液的化學(xué)發(fā)光光譜(圖3)。結(jié)果表明：Luminol-NaIO4-Praziquantel與Luminol-NaIO4的最大發(fā)射波長均在425 nm左右，與文獻(xiàn)報(bào)道的Luminol氧化產(chǎn)物—3-氨基鄰苯二甲酸根離子(3-APA*)的最大發(fā)射波長類似[20]，這表明無論吡喹酮是否參與反應(yīng)，該體系的發(fā)光體始終為激發(fā)態(tài)的3-APA*。

為進(jìn)一步探討吡喹酮對(duì)Luminol-NaIO4體系抑制作用的反應(yīng)機(jī)理，本研究采用紫外-可見分光光度計(jì)分別測(cè)定了溶液不同混合方式的紫外吸收光譜(圖4)。如圖所示，Luminol與NaIO4混合溶液的吸收光譜(曲線d)并不是由Luminol(曲線b)與NaIO4(曲線a)的吸收光譜純粹疊加所形成。Luminol在221、300、347 nm處的吸收峰值降低，NaIO4在194 nm處的吸收峰值消失，說明Luminol與NaIO4發(fā)生了反應(yīng)。當(dāng)向Luminol-NaIO4體系加入吡喹酮溶液時(shí)，對(duì)比曲線d和g，兩者吸收峰的位置大致相似，而吡喹酮在201 nm處的吸收峰消失(曲線c)，NaIO4在194 nm處(曲線a)的吸收峰消失，Luminol的特征吸收峰略有降低，說明吡喹酮與體系中的NaIO4發(fā)生了反應(yīng)，導(dǎo)致其吸收光譜的峰形發(fā)生了變化。

圖3 魯米諾化學(xué)反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光光譜Fig.3 Chemiluminescence spectra of luminol chemical reactionsc(Luminol)=5.0×10-3 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(Praziquantel)=1.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=0.1 mol/L

圖4 不同溶液的紫外-可見吸收光譜Fig.4 Ultraviolet-Visible absorption spectra of different solutionsc(Luminol)=5.0×10-3 mol/L;c(NaIO4)=3.0×10-4 mol/L;c(Praziquantel)=1.0×10-4 mol/L;c(NaOH)=0.1 mol/L

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 流路及儀器參數(shù)的選擇為了獲得最佳的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)不同流路、混合管長度(3～9 cm)以及光電倍增管負(fù)高壓(500～700 V)進(jìn)行考察。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)采用圖1的流路，且混合管長度為7 cm，光電倍增管負(fù)高壓為550 V時(shí)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大且信號(hào)穩(wěn)定。

2.2.2 流速的選擇試劑的流速會(huì)對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度造成一定影響，因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)P1泵(1.4～3.0 mL/min)與P2泵(1.3～3.0 mL/min)的流速進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)P1泵的流速在1.4～1.9 mL/min范圍時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度隨著流速的增加而增加；而當(dāng)流速大于1.9 mL/min時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度反而下降。實(shí)驗(yàn)表明：Luminol與NaOH混合溶液的進(jìn)樣速率會(huì)直接影響發(fā)光強(qiáng)度的大小，且當(dāng)P1泵的流速為1.9 mL/min時(shí)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最佳。因此，選擇1.9 mL/min作為P1泵的最佳流速。同理分析可知，當(dāng)P2泵的流速在1.3～2.4 mL/min范圍時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度隨流速的增加而增加；當(dāng)流速大于2.4 mL/min時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度反而下降。因此，選擇2.4 mL/min作為P2泵的最佳流速。

2.2.3 化學(xué)發(fā)光試劑的優(yōu)化對(duì)該體系中所有試劑(NaOH、Luminol及NaIO4)的濃度進(jìn)行優(yōu)化。由于介質(zhì)的堿性強(qiáng)弱對(duì)該體系具有重要影響，且不同的堿性介質(zhì)對(duì)發(fā)光強(qiáng)度的作用也不同。實(shí)驗(yàn)配制了相同濃度的NaOH、Na2CO3和NaHCO3等堿性溶液，分別以此3種溶液作為該體系的堿性介質(zhì)。結(jié)果表明，在以NaOH為堿性介質(zhì)時(shí)，吡喹酮的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)穩(wěn)定且檢測(cè)信號(hào)好。因此，實(shí)驗(yàn)選用NaOH作為檢測(cè)體系的堿性介質(zhì)。進(jìn)一步考察不同濃度NaOH(1.0×10-4～2.0×10-2mol/L)對(duì)體系的影響。結(jié)果顯示，初始階段，體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨著NaOH濃度的增加而增加，當(dāng)濃度為8.0×10-3mol/L時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最高，隨著NaOH濃度的繼續(xù)增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度反而減小，因此實(shí)驗(yàn)選擇8.0×10-3mol/L作為NaOH的最佳濃度。

Luminol作為化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中的發(fā)光劑，其濃度變化也對(duì)該體系的發(fā)光強(qiáng)度、檢測(cè)靈敏度以及線性變化產(chǎn)生直接影響。本實(shí)驗(yàn)考察了Luminol在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)的影響。結(jié)果顯示，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨Luminol濃度的增加而增加，當(dāng)其達(dá)到4.0×10-4mol/L后，化學(xué)發(fā)光信號(hào)的強(qiáng)度逐漸趨于平穩(wěn)，從試劑的節(jié)約性考慮，選擇Luminol溶液的最佳濃度為4.0×10-4mol/L。

NaIO4作為該實(shí)驗(yàn)體系的氧化劑，其濃度同樣影響著發(fā)光強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)對(duì)NaIO4在1.0×10-5～1.0×10-3mol/L濃度范圍內(nèi)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，體系的化學(xué)發(fā)光信號(hào)隨著NaIO4濃度的增大而增大，當(dāng)濃度為3.0×10-4mol/L時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，隨著其濃度的繼續(xù)增大，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的增加逐漸減緩，因此實(shí)驗(yàn)選擇NaIO4的最佳濃度為3.0×10-4mol/L。

圖5 不同濃度吡喹酮在Luminol-NaIO4體系的流動(dòng)注射信號(hào)Fig.5 Typical flow injection signals for different concentrations of praziquantel in the Luminol-NaIO4 systeminset:linear calibration curve in different praziquantel concentrations

2.3 線性范圍、檢出限與精密度

在最佳條件下，考察了不同濃度吡喹酮與相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(ΔI)的線性關(guān)系。結(jié)果顯示，吡喹酮濃度在4.0×10-8～1.0×10-6mol/L范圍內(nèi)與ΔI呈良好線性關(guān)系，且不同濃度的吡喹酮在Luminol-NaIO4體系中隨時(shí)間的遞增呈逐漸遞減的規(guī)律性變化(圖5)。吡喹酮的檢出限(3σ)為9.9×10-9mol/L，其線性方程為：ΔI=96.48c+84.38(c的單位為10-7mol/L)，r2=0.991 1。對(duì)2.0×10-7mol/L的吡喹酮溶液平行測(cè)定11次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%。

將本方法與文獻(xiàn)報(bào)道檢測(cè)吡喹酮的方法進(jìn)行比較，由表1可知，與其它方法相比，此方法具有使用儀器簡單、檢測(cè)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

表1 不同方法測(cè)定吡喹酮的比較Table 1 Comparison of different methods for determination of praziquantel

* no data

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.5 樣品的測(cè)定

所測(cè)豬飼料樣品均購自周邊農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的，對(duì)購買的豬飼料進(jìn)行前處理[23]，然后按照“1.2”方法，將其稀釋至線性范圍內(nèi)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)該方法的準(zhǔn)確性(表2)。結(jié)果顯示：按不同濃度進(jìn)行加標(biāo)后，測(cè)得豬飼料中吡喹酮的加標(biāo)回收率為98.5%～100%，RSD為1.6%～2.4%。

表2 豬飼料中吡喹酮含量的測(cè)定結(jié)果(n=7)Table 2 Determination results of praziquantel in pig feed(n=7)

*no data

3 結(jié) 論

本文基于吡喹酮對(duì)Luminol-NaIO4化學(xué)發(fā)光體系較強(qiáng)的抑制作用，聯(lián)合流動(dòng)注射技術(shù)，建立了一種簡單、快速、靈敏測(cè)定吡喹酮的新方法。該方法的檢測(cè)范圍為4.0×10-8～1.0×10-6mol/L，檢出限為9.9×10-9mol/L，加標(biāo)回收率為98.5%～100%。該方法靈敏度高、分析速度快，可用于豬飼料中吡喹酮含量的測(cè)定。