應(yīng)用介孔分子印跡聚合物萃取糧食中的乙酰甲胺磷

譚鈺清，孫夢(mèng)謠，劉宇婷，張伽宜，李智昊，陳立鋼

(東北林業(yè)大學(xué) 理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000)

乙酰甲胺磷是農(nóng)業(yè)種植過(guò)程使用較多的內(nèi)吸性有機(jī)磷殺蟲劑，具有低毒、廣譜、高效的特點(diǎn)，當(dāng)其進(jìn)入人體后會(huì)抑制膽堿酯酶，對(duì)人體傷害很大。所以測(cè)定食品中乙酰甲胺磷殘留至關(guān)重要[1-2]。乙酰甲胺磷殘留的傳統(tǒng)檢測(cè)方法是采用乙腈提取，再經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析測(cè)定，但該方法選擇性較差，抗干擾能力弱，萃取率低，分析準(zhǔn)確性較低[3-4]。

相較于傳統(tǒng)檢測(cè)方法的不足，本研究引入分子印跡聚合物作為乙酰甲胺磷萃取分離的吸附劑。分子印跡聚合物是一類具有特定功能基團(tuán)、空穴大小形狀的高分子材料，具有穩(wěn)定性好、選擇性高、耐高溫高壓和酸堿的優(yōu)點(diǎn)。其模板分子可與聚合物單體接觸形成多重作用點(diǎn)，在聚合中被記憶下來(lái)；移除模板分子后，在聚合物中留有多個(gè)與其空間構(gòu)型相匹配且對(duì)模板分子具有選擇識(shí)別特性的空穴[5-7]。

傳統(tǒng)分子印跡聚合物大多采用本體聚合的方式制備，得到的材料孔徑較小，且難以控制，因而吸附容量較低，吸附解吸動(dòng)力學(xué)緩慢。介孔材料是一種具有大比表面積和三維孔結(jié)構(gòu)的新型材料，孔徑介于微孔與大孔(2～50 nm)之間，具有孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則有序、孔徑分布狹窄、孔徑大小連續(xù)可調(diào)等特點(diǎn)[8-9]。將其作為分子印跡聚合物的基體，可兼得兩者優(yōu)點(diǎn)，使材料吸附性更好。

本實(shí)驗(yàn)采用分子印跡和自組裝技術(shù)，通過(guò)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸乙酯在中性介質(zhì)下水解、凝聚、縮合，使有機(jī)基團(tuán)與介孔硅膠基體結(jié)合，制備一種新的介孔分子印跡聚合物，并通過(guò)動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)和競(jìng)爭(zhēng)吸附等手段，研究其對(duì)乙酰甲胺磷的吸附機(jī)理和選擇性[10-11]。將其作為基質(zhì)固相分散萃取的分散劑，結(jié)合高效液相色譜法，對(duì)糧食中乙酰甲胺磷殘留進(jìn)行分析。該方法可實(shí)現(xiàn)乙酰甲胺磷的高選擇性萃取分離，且提高了分析速度，節(jié)約了有機(jī)溶劑用量，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

乙酰甲胺磷(純度99%)，毒死蜱(純度99.5%)，草甘膦(純度95%)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(純度99%)，正硅酸乙酯(純度98%)，正十二烷胺(DDA，純度95%)，甲醇、乙醇、乙腈、冰醋酸(均為分析純)，甲醇(色譜純，僅用于配制流動(dòng)相)，以上試劑均購(gòu)于上海阿拉丁；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水；大米、黃豆、糯米、薏米樣品均購(gòu)于哈爾濱當(dāng)?shù)爻小?/p>

LC-15C高效液相色譜儀配置紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；FEI Sirion掃描電鏡(荷蘭飛利浦公司)；ASAP 2020全自動(dòng)比表面積和孔隙度分析儀(美國(guó)Micromeritics公司)；FT-IR360傅立葉紅外光譜儀(美國(guó)Nicolet公司)；萃取小柱為3 mL聚丙烯固相萃取空柱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 介孔分子印跡聚合物的制備將100 mg乙酰甲胺磷溶于30 mL乙醇和20 mL水中，加入3 mL APTES，常溫下均勻攪拌10 h；加入2 g DDA(50 mL乙醇溶解)和6 mL正硅酸乙酯，常溫下攪拌反應(yīng)24 h，用乙醇洗滌并以7 000 r/min離心7 min后，置于真空干燥箱中60 ℃烘干15 h，得粉末狀聚合物；用甲醇-乙酸(4∶1，體積比)進(jìn)行索氏提取56 h，以除去模板分子和致孔劑；置于真空干燥箱中60 ℃烘干24 h，即得介孔分子印跡聚合物(MIP)。

采用同法制備介孔非分子印跡聚合物(NIP)，僅不加入模板分子乙酰甲胺磷。

1.2.2 吸附實(shí)驗(yàn)取4 mL 200、160、120、80、60、40、20、10 μg/mL的乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入10 mg MIP和NIP，于25 ℃水浴恒溫振蕩24 h，進(jìn)行等溫吸附實(shí)驗(yàn)。經(jīng)濾膜過(guò)濾后，用高效液相色譜檢測(cè)溶液中乙酰甲胺磷的剩余濃度。根據(jù)公式Q=(C0-Ct)V/m計(jì)算聚合物對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量(Q)，其中C0為乙酰甲胺磷的初始濃度(mg/L)，Ct為其平衡濃度(mg/L)，V為吸附溶液體積(mL)，m為聚合物質(zhì)量(mg)。采用Scatchard分析討論聚合物的吸附情況，擬合方程為Q/Ct=(Qmax-Q)/kd，其中Qmax為最大表觀結(jié)合量(mg/g)，kd為結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)(mg/L)。

分別在35 ℃和45 ℃下重復(fù)上述步驟，進(jìn)行吸附熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

取4 mL 200 μg/mL乙酰甲胺磷溶液分別加入10 mg MIP和NIP，于25 ℃恒溫水浴分別振蕩2～180 min，檢測(cè)乙酰甲胺磷的剩余濃度，進(jìn)行吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。

應(yīng)用乙酰甲胺磷、草甘膦和毒死蜱考察MIP的特異性選擇能力。分別取4 mL 200 μg/mL的乙酰甲胺磷、毒死蜱、草甘膦溶液加入10 mg MIP，在室溫下振蕩24 h，檢測(cè)溶液的剩余濃度，進(jìn)行選擇性吸附實(shí)驗(yàn)。用NIP重復(fù)上述步驟。

1.2.3 基質(zhì)固相分散萃取法提取糧食中的乙酰甲胺磷將糧食樣品與MIP按1∶1的質(zhì)量比混合研磨8 min后，裝入萃取小柱中，依次用4 mL乙醇-水(2∶1，體積比)淋洗和4 mL乙腈-乙酸(19∶1，體積比)洗脫，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈珊笾匦氯苡?.0 mL色譜流動(dòng)相中。以乙酰甲胺磷的相對(duì)回收率評(píng)價(jià)萃取效果：相對(duì)回收率(%)=(加標(biāo)樣品中乙酰甲胺磷的檢測(cè)濃度-樣品中乙酰甲胺磷的初始濃度)/乙酰甲胺磷的加標(biāo)濃度×100%。

1.2.4 色譜條件Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(20∶0.5∶80，體積比)，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣體積為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 介孔分子印跡聚合物的表征

圖1 介孔分子印跡聚合物的紅外光譜圖(A)及掃描電鏡圖(B)
Fig.1 Infared spectrum(A) and scanning electron microscopy image(B) of MIP

MIP的N2吸附-脫附等溫線及孔徑分布曲線見(jiàn)圖2。如圖2A所示，其N2吸附-脫附等溫線符合Langmiur Ⅳ型曲線，形成了明顯的滯后環(huán)，表明其介孔豐富。如圖2B所示，孔徑分布曲線的波峰位于3～4 nm，證明此處為最可幾孔徑，介孔孔隙最大。儀器檢測(cè)結(jié)果顯示，MIP的比表面積為770.52 m2·g-1，最可幾孔徑為3.99 nm，孔容為1.28 cm3·g-1。

圖2 MIP的N2吸附-脫附等溫線(A)及孔徑分布曲線(B)
Fig.2 Nitrogen adsorption-desorption isotherms(A) and BJH pore size distribution plot(B) of MIP

2.2 吸附等溫線的測(cè)定與Scatchard分析

測(cè)試了MIP和NIP的吸附等溫線，發(fā)現(xiàn)MIP的吸附等溫線隨乙酰甲胺磷濃度的變化趨勢(shì)比NIP明顯(圖3A)；在相同濃度下，MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。說(shuō)明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的特定識(shí)別使其吸附能力增強(qiáng)。

以Q/Ct對(duì)Q作圖得到Scatchard分析曲線，如圖3B所示，MIP擬合為折線型，說(shuō)明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附非均一，聚合物的結(jié)合位點(diǎn)呈各向異性。兩條擬合直線說(shuō)明該聚合物對(duì)乙酰甲胺磷有兩種結(jié)合方式，計(jì)算其截距和斜率[12-13]為：Qmax1=47.03 mg/g,kd1=57.14 mg/L;Qmax2=90.31 mg/g,kd2=188.68 mg/L。該方法制得的介孔MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附總量為137.34 mg/g(Qmax1+Qmax2)，遠(yuǎn)大于采用傳統(tǒng)方法制得的非介孔MIP對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的吸附量(27.38 mg/g)[14]。如圖3C所示，NIP擬合為直線型，說(shuō)明NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附均一，聚合物的結(jié)合位點(diǎn)呈等價(jià)性，由擬合直線的截距和斜率求得：Qmax=35.58 mg/g,kd=208.33 mg/L。通過(guò)比較最大表觀結(jié)合量，說(shuō)明MIP的結(jié)合能力高于NIP。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定

測(cè)試了MIP和NIP的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果顯示，MIP的前期吸附速率高，15 min左右達(dá)到吸附總量的85%，在40～50 min時(shí)達(dá)到吸附平衡，快速的吸附平衡表明聚合物中識(shí)別位點(diǎn)對(duì)乙酰甲胺磷表現(xiàn)出較好的親和性。前10 min的吸附曲線斜率較大，是由于此時(shí)印跡位點(diǎn)空穴較多，粒子內(nèi)的擴(kuò)散速度較大；50 min后的吸附曲線較為平緩，可能是由于吸附接近平衡后，印跡位點(diǎn)多被占據(jù)，剩余的吸附質(zhì)濃度較低，粒子內(nèi)的擴(kuò)散速度變緩所致。NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附動(dòng)力學(xué)曲線變化趨勢(shì)與MIP類似，但其吸附量整體低于MIP。

2.4 吸附熱力學(xué)曲線的測(cè)定

MIP和NIP的吸附熱力學(xué)曲線如圖4A、B所示，結(jié)果顯示MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量均隨反應(yīng)溫度的升高而降低；相同溫度下，MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量大于NIP。表明MIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附為放熱過(guò)程，低溫更利于兩者的結(jié)合使其吸附能力增強(qiáng)。

分別計(jì)算得到25、35、45 ℃下MIP的準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)吸附速率常數(shù)分別為8.0×10-7、3.7×10-7、2.0×10-7min-1，并以lnk2對(duì)1/T作圖，擬合方程為lnk2=-ΔH0/(RT)+ΔS0/R，其中T為溫度(K)，ΔH0為焓變(J/mol)，ΔS0為熵變 J/(mol·K)。如圖4C所示，lnk2與1/T呈較好的線性關(guān)系，由斜率可求得MIP吸附乙酰甲胺磷的焓變?yōu)?637.48 J/mol，由截距可求得熵變?yōu)?8.307 J/(mol· K)。ΔH0為負(fù)值表明吸附為放熱過(guò)程，ΔS0為正值表明吸附為焓推動(dòng)過(guò)程。將ΔH0和ΔS0代入方程ΔG0=ΔH0-TΔS0，計(jì)算在25、35、45 ℃下乙酰甲胺磷的ΔG0分別為-6.09、-6.28、-6.46 kJ/mol，ΔG0均小于0，表明吸附為自發(fā)過(guò)程。

2.5 選擇性吸附的研究

考察了MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷、草甘膦及毒死蜱的吸附情況。由于草甘膦和乙酰甲胺磷的結(jié)構(gòu)較為相似，且具有相同的官能團(tuán)(如羥基和亞氨基)，故以其作為乙酰甲胺磷的結(jié)構(gòu)類似物，此外選用結(jié)構(gòu)差異較大的毒死蜱為參照物。結(jié)果顯示，MIP對(duì)乙酰甲胺磷和草甘膦的吸附率(分別為92%和33%)明顯大于NIP(分別為38%和29%)，說(shuō)明MIP對(duì)兩者均有良好的選擇性吸附；MIP和NIP對(duì)乙酰甲胺磷的吸附率最大(分別為92%和38%)，對(duì)毒死蜱的吸附率最小(分別為5%和4%)。表明MIP對(duì)于模板分子乙酰甲胺磷具有良好的選擇性。

2.6 基質(zhì)固相分散萃取條件的優(yōu)化

2.6.1 研磨時(shí)間與混合物比例的確定將一定比例的MIP和樣品混合物分別研磨2～15 min，用相同的溶液淋洗和洗脫，結(jié)果顯示，MIP的吸附能力隨研磨時(shí)間的增加而增強(qiáng)；研磨8 min時(shí)得到的回收率為94.6%，此后增加研磨時(shí)間，回收率無(wú)明顯增強(qiáng)，故選擇最佳研磨時(shí)間為8 min。隨后將MIP和樣品按不同質(zhì)量比(1∶2、2∶3、1∶1、3∶2、2∶1)混合研磨8 min，淋洗并洗脫，結(jié)果表明，當(dāng)樣品和MIP的質(zhì)量比為1∶1時(shí)回收率最大(為96.7%)，故確定兩者比例為1∶1。

2.6.2 淋洗劑種類及比例的確定將MIP和樣品按上述確定的條件混合，分別用相同比例的乙腈-水、乙醇-水和甲醇-水淋洗并用相同的溶液洗脫，得到回收率分別為35.6%、98.2%和73.4%，因此確定采用乙醇-水為淋洗劑。進(jìn)一步對(duì)乙醇和水的體積比進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)乙醇含量增多可洗脫更多雜質(zhì)，但損失的乙酰甲胺磷也增多，使得回收率降低。綜合考慮，選擇體積比為2∶1的乙醇-水為淋洗劑。

圖5 加標(biāo)大米樣品中乙酰甲胺磷的液相色譜圖(加標(biāo)0.05 μg/g)Fig.5 Chromatogram of acephate in spiked rice sample(spiked 0.05 μg/g)

2.6.3 洗脫劑種類及體積的確定將MIP和樣品按上述確定的條件混合并淋洗，分別用體積比為19∶1和18∶2的乙腈-乙酸溶液、乙醇-乙酸溶液和甲醇-乙酸溶液洗脫，結(jié)果顯示采用乙腈-乙酸溶液(19∶1)洗脫得到的回收率最高(達(dá)92.9%)，因此選擇乙腈-乙酸溶液(19∶1)為洗脫劑。相同條件下，對(duì)乙腈-乙酸溶液(19∶1)的體積(1～5 mL)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)洗脫劑體積小于4 mL時(shí)回收率較低(<80%)，洗脫劑體積大于4 mL時(shí)回收率無(wú)明顯增長(zhǎng)。因此確定洗脫劑的最佳體積為4 mL。

2.6.4 MIP普用性考察在最優(yōu)條件下分別對(duì)大米、黃豆、糯米和薏米中的乙酰甲胺磷進(jìn)行萃取分離，回收率均能達(dá)到90%以上，表明制備的MIP適用于多種糧食中乙酰甲胺磷的萃取。

2.7 分析方法的評(píng)價(jià)與應(yīng)用

將制備得到的介孔分子印跡聚合物用于基質(zhì)固相分散萃取空白大米中的乙酰甲胺磷，萃取條件如“1.2.3”所示，將得到的萃取空白溶液對(duì)乙酰甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，然后按“1.2.4”條件進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，得到乙酰甲胺磷的回歸方程為A=1 019.9c+19 722(A為峰面積，c為乙酰甲胺磷濃度)，r2=0.998 9，線性范圍為0.03～0.3 μg/g，以3倍信噪比計(jì)算檢出限為0.015 μg/g?？瞻状竺讟悠分屑訕?biāo)乙酰甲胺磷的液相色譜圖如圖5所示。根據(jù)國(guó)標(biāo)[16]可知，乙酰甲胺磷在谷物類中限量值為0.2 mg/kg，其他食品中為0.5 mg/kg，故本方法滿足檢測(cè)要求。

從哈爾濱當(dāng)?shù)刭?gòu)買大米、黃豆、糯米、薏米4種糧食，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出乙酰甲胺磷。隨后對(duì)該4種糧食樣品在3個(gè)濃度下(0.03、0.1、0.3 μg/g)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，得到回收率為92.5%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.9%～3.7%，表明本方法可用于糧食中乙酰甲胺磷的分離分析。

3 結(jié) 論

本文以乙酰甲胺磷為模板分子，采用溶膠凝膠技術(shù)制備了介孔分子印跡聚合物，對(duì)其進(jìn)行等溫吸附、動(dòng)力學(xué)吸附、熱力學(xué)吸附及Scatchard分析。結(jié)果顯示該聚合物對(duì)乙酰甲胺磷具有較好的吸附效果。且由于其具有介孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，因此對(duì)乙酰甲胺磷的吸附量高于傳統(tǒng)的分子印跡聚合物。將所制得的MIP應(yīng)用于基質(zhì)固相分散萃取糧食中的乙酰甲胺磷，并采用高效液相色譜法進(jìn)行分析，得到了理想的回收率。該方法將固體樣品的萃取和凈化在一個(gè)體系中同步完成，減少了樣品預(yù)處理步驟，分離速度快，準(zhǔn)確度高，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。