聚偏氟乙烯微孔濾膜-聚多巴胺-氧化石墨烯固相萃取結(jié)合離子遷移譜快速檢測(cè)尿液中的麻黃堿

柴常偉，劉 迪，崔毅軒，管宇珊，龐 羽，王子晗，蔣 曄

(河北醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，河北 石家莊 050017)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，機(jī)動(dòng)車(chē)給人帶來(lái)方便的同時(shí)，交通事故也給駕駛?cè)思奥啡嗽斐刹豢赡鎮(zhèn)1]。目前，因飲酒、非法藥物使用及藥物濫用后駕車(chē)已成為交通事故的主要原因[2-6]。藥駕(Driving under the inference of drugs,DUID)[7-8]指在藥物的影響下駕駛，易誘發(fā)交通事故。影響駕駛能力的藥物根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)有不同的分類(lèi)結(jié)果[9-11]。依據(jù)藥效作用分類(lèi)，主要包括毒品類(lèi)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制藥、三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥物、抗糖尿病藥物、抗高血壓藥物、抗組胺藥等[11]。當(dāng)今，交通管理部門(mén)對(duì)于禁止酒駕的宣傳及檢查已相對(duì)完善，但對(duì)于藥駕方面的交通安全宣傳和整治卻迫在眉睫。同時(shí)，高空駕駛?cè)藛T(如飛機(jī)駕駛員)的不合理用藥而引起的藥物不良反應(yīng)也給飛行人員健康和飛行安全帶來(lái)危害和隱患[12-14]。為進(jìn)一步規(guī)范駕駛行為并保證交通、飛行安全，建立藥駕在線檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)察的方法刻不容緩。

麻黃堿(Ephedrine，EPH)作為生物堿類(lèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，通過(guò)人體代謝，主要經(jīng)腎臟以原形從尿液中排泄[15]，具有發(fā)汗、平喘、利尿、抗炎、抗過(guò)敏、鎮(zhèn)咳、祛痰、解熱、抗菌、抗病毒等藥用功效，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域[16]。然而，由于EPH引發(fā)的神經(jīng)過(guò)敏、耳鳴、失眠、血壓升高、頭痛、頭暈、心慌、血糖升高、心前區(qū)疼痛、心動(dòng)過(guò)速、心動(dòng)過(guò)緩、心律失常等不良反應(yīng)[17-19]，會(huì)嚴(yán)重影響駕駛安全，因此建立尿液中EPH的快速檢測(cè)尤為重要。目前，已報(bào)道的關(guān)于麻黃堿的檢測(cè)手段很多[16]，主要包括光譜法、色譜法[20-26]、電泳法[27-29]、聯(lián)用技術(shù)[22-24,26]等，其中光譜法[16]主要用于制劑中EPH的檢測(cè)；色譜法、電泳法、聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于尿液中的EPH檢測(cè)，但這些實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段由于儀器體積及分析時(shí)間的限制，不適合現(xiàn)場(chǎng)快檢。對(duì)于尿液中EPH的前處理方法主要包括液液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)[20-21,25-26,28-29]和固相萃取(Solid phase extraction，SPE)[22-24]。但LLE萃取和溶劑轉(zhuǎn)換過(guò)程需消耗大量時(shí)間；SPE需活化、淋洗、洗脫等繁瑣步驟，且吸附不具有特異性。由此可見(jiàn)，已有的前處理方法和檢測(cè)手段均不適用于尿液中EPH的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

氧化石墨烯(GO)是一種由單層碳原子構(gòu)成的呈蜂窩狀的二維平面薄膜，主要由碳原子和極性含氧官能團(tuán)組成，位于表面的羥基和環(huán)氧基，以及處于邊緣的羧基使其具有極強(qiáng)的親水性[30]。GO作為一種新型吸附劑，被廣泛應(yīng)用于固相萃取[31-34]。便攜式高分辨離子遷移譜(Portable high resolution ion mobility spectrometry,PHR-IMS)作為一種大氣壓下對(duì)帶電物質(zhì)進(jìn)行分離的檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、分析速度快、體積小、便攜等優(yōu)點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于爆炸物的檢測(cè)。隨著離子遷移譜(IMS)的發(fā)展，其在藥物分析方面的應(yīng)用嶄露頭角[35-37]。基于此，本文首次采用聚偏氟乙烯微孔濾膜(PVDF)為支撐載體，GO為萃取劑，聚多巴胺為交聯(lián)劑，交聯(lián)GO與PVDF，建立了聚偏氟乙烯微孔濾膜-聚多巴胺-氧化石墨烯固相萃取(Polyvinylidene fluoride microporous membrane-polydopamine-graphene oxide solid phase extraction,PVDF-PD-GO-SPE)結(jié)合PHR-IMS快速檢測(cè)尿液中EPH的分析方法，PVDF膜幾分鐘即可完成吸附過(guò)程，相比于攪拌棒[33]，顯著節(jié)省了吸附時(shí)間，可為藥駕在線檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)察提供有效手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Excellims GA2100高效離子遷移譜儀，電噴霧離子源，進(jìn)樣方式為直接進(jìn)樣。VisIon Analysis分析軟件(Analysis_2_3_1_23)；Sartorius BP 211D(十萬(wàn)分之一，上海耀壯檢測(cè)儀器設(shè)備有限公司)電子天平；Milli-Q 50超純水系統(tǒng)；T1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京譜析通用儀器有限公司)；FTIR-8400S 紅外光譜儀(日本島津公司)；S-3500掃描電子顯微鏡(日本日立公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋(鞏義市科華儀器設(shè)備有限公司)。

聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型)(上海興亞凈化材料廠，規(guī)格Φ50 mm)；甲醇(色譜純，F(xiàn)isher公司)；鹽酸麻黃堿(純度>98%，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):714-8501)；氧化石墨烯為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)紫外光譜、傅立葉紅外光譜、掃描電鏡表征；鹽酸多巴胺(純度>99%，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris試劑純度>99%，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)；急支糖漿(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司)；所用其它試劑均為分析純。健康受試者尿樣于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 溶液的配制

1.2.1 聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液的制備稱取Tris試劑約0.363 g于300 mL水中溶解，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.5，得10 mmol/L的Tris-HCl溶液；稱取約0.6 g的鹽酸多巴胺于10 mmol/L的Tris-HCl溶液中溶解，超聲攪拌至溶液呈棕黑色，即得2 mg/L的聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液。

1.2.2 鹽酸麻黃堿對(duì)照品的制備精確稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品25.82 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制得質(zhì)量濃度為1.033 mg/mL的鹽酸麻黃堿甲醇對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取甲醇儲(chǔ)備液制備1.033 μg/mL的麻黃堿甲醇溶液。

精確稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品12.37 mg于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，得質(zhì)量濃度為123.7 μg/mL的鹽酸麻黃堿水溶液儲(chǔ)備液。

1.2.3 加標(biāo)樣品溶液的制備取近期未服用含有麻黃堿藥品的健康成年人尿液作為空白樣品進(jìn)行測(cè)定。分別取123.7 μg/mL的鹽酸麻黃堿水溶液儲(chǔ)備液0.25、1.0、5.0 mL于100 mL容量瓶中，用空白尿樣進(jìn)行稀釋，得0.309、1.237、6.185 μg/mL 3個(gè)質(zhì)量濃度水平的加標(biāo)樣品溶液。

1.3 PVDF-PD-GO-SPE的制備

參考文獻(xiàn)[33-34]制備氧化石墨烯，并采用紫外光譜、傅立葉紅外光譜、掃描電鏡表征，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。取20 mg氧化石墨烯超聲分散于20 mL水中，即得1 mg/mL氧化石墨烯溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。首先將聚偏氟乙烯微孔濾膜用甲醇清洗，干燥。然后將干燥好的濾膜放入聚多巴胺-Tris-HCl緩沖溶液中，于30 ℃水浴中攪拌12 h。待反應(yīng)完成后，將濾膜干燥，即得聚多巴胺涂層的濾膜。然后將其放入氧化石墨烯溶液(1 mg/mL)中，于65 ℃水浴中反應(yīng)10 h后取出，干燥。重復(fù)以上步驟2次，即得具有一定厚度的氧化石墨烯鍍層濾膜(PVDF-PD-GO-SPE)。再將該膜用甲醇超聲清洗10 min，干燥，待用。

1.4 樣品前處理

吸附過(guò)程：將萃取膜卷成管狀置于10 mL離心管中，加入加標(biāo)尿樣溶液10 mL，渦旋吸附5 min，棄去樣品溶液；去基質(zhì)過(guò)程：用5 mL超純水清洗萃取膜及離心管，棄去洗滌水，重復(fù)3次；洗脫過(guò)程：加入甲醇1 mL，渦旋洗脫10 min，洗脫液待測(cè)。操作流程見(jiàn)圖1。

圖1 樣品處理過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic of the experimentation

1.5 IMS分析

進(jìn)樣前，取校正溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正，校正完成后，取樣品溶液30～40 μL，進(jìn)行IMS分析。IMS工作模式為正離子模式，源電壓2 800 V，遷移管電壓8 400 V，氣體進(jìn)樣溫度170 ℃，遷移管溫度170 ℃，門(mén)電壓寬度120 μs，門(mén)電壓50 V，譜圖時(shí)長(zhǎng)26 ms；溶劑延遲0 ms，譜圖疊加10次，采集運(yùn)行時(shí)長(zhǎng)10 s，采集速率200 K Samples/Sec；排氣泵速率1.25 L·min-1，遷移氣速率1.00 L·min-1；直接噴霧進(jìn)樣流速1.0 μL·min-1，進(jìn)樣針直徑1.46 mm。

2 結(jié)果與討論

2.1 IMS操作參數(shù)優(yōu)化

為提高EPH在離子遷移譜上的響應(yīng)強(qiáng)度，從而進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，實(shí)驗(yàn)取1.033 μg/mL麻黃堿甲醇溶液進(jìn)樣，對(duì)離子遷移譜的主要檢測(cè)參數(shù)如遷移管電壓(7 500～8 500 V)、遷移管溫度(140～180 ℃)、門(mén)電壓(40～90 V)、門(mén)寬度(80～130 μs)進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化范圍上限依據(jù)儀器所允許的最大值界定。

遷移管電壓和遷移管溫度是影響待測(cè)物響應(yīng)強(qiáng)度及分辨率的重要參數(shù)，因此實(shí)驗(yàn)考察了遷移管電壓和遷移管溫度對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度及遷移時(shí)間的影響。結(jié)果顯示，遷移時(shí)間與遷移管電壓呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r2=0.998)；響應(yīng)強(qiáng)度在7 500～8 400 V范圍內(nèi)與遷移管電壓呈正相關(guān)(r2=0.991)，且在8 400V時(shí)響應(yīng)強(qiáng)度最大，因此遷移管電壓以最優(yōu)值8 400 V為儀器使用條件。在優(yōu)化范圍內(nèi)，遷移管溫度與遷移時(shí)間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(r2=0.980)；而遷移管溫度與響應(yīng)強(qiáng)度無(wú)相關(guān)性，但在170 ℃時(shí)的響應(yīng)強(qiáng)度最大。遷移管電壓與溫度對(duì)遷移時(shí)間負(fù)相關(guān)的依賴性，表明帶電離子在遷移管內(nèi)的遷移行為的改變不可忽略。

離子化物質(zhì)具有一定的能量才能克服門(mén)電壓的限制進(jìn)入遷移管，同時(shí)門(mén)電壓限制了其他弱電物質(zhì)進(jìn)入遷移管，增大待測(cè)物的響應(yīng)強(qiáng)度，但若門(mén)電壓過(guò)高，待測(cè)物能量過(guò)低則進(jìn)入遷移管的量降低，降低了待測(cè)物響應(yīng)強(qiáng)度，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)門(mén)電壓為50 V是最適條件。另外，門(mén)寬度越大，進(jìn)入遷移管的待測(cè)物響應(yīng)越高，但同時(shí)基線波動(dòng)越大，靈敏度越低，因此選擇門(mén)寬度為120 μs。

2.2 PVDF-PD-GO-SPE鍍膜次數(shù)的優(yōu)化

考察了聚多巴胺-氧化石墨烯鍍膜次數(shù)(0、1、2、3次)對(duì)PVDF-PD-GO-SPE吸附性能的影響(圖2)，結(jié)果顯示，未鍍膜的空白PVDF膜(曲線E)對(duì)EPH有少量吸附，吸附率為1.6%，而鍍膜之后(曲線B、C、D)的PVDF-PD-GO-SPE對(duì)EPH萃取效率顯著提高，因此空白膜的少量吸附可以忽略，且鍍膜2次(曲線C)與3次(曲線B)的萃取效率無(wú)明顯差異，為了節(jié)約時(shí)間成本，本研究選擇PVDF-PD-GO-SPE鍍膜2次。

圖2 PVDF-PD-GO-SPE鍍膜次數(shù)的優(yōu)化Fig.2 The optimization of coating times on PVDF-PD-GO-SPEA.ephedrine control peak，B.coating three times，C.coating two times，D.coating one time，E.blank film

2.3 萃取過(guò)程的優(yōu)化

2.3.1 樣品溶液及洗脫溶劑體積的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)考察了吸附過(guò)程中，樣品溶液體積(2、5、10 mL)對(duì)EPH響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)樣品溶液體積為2、5 mL時(shí)，渦旋順利進(jìn)行，響應(yīng)強(qiáng)度為0.541～0.607 V；當(dāng)樣品溶液體積為10 mL時(shí)，樣品溶液處于震蕩狀態(tài)，渦旋操作受限，響應(yīng)強(qiáng)度為0.781～0.868 V。推測(cè)該現(xiàn)象的可能原因?yàn)椋何竭^(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)結(jié)合-解吸過(guò)程，當(dāng)渦旋順利進(jìn)行時(shí)，渦旋作用力較大，待測(cè)組分與氧化石墨烯之間的吸附力不足以克服渦旋作用力，造成已吸附的待測(cè)物又回到溶液中；當(dāng)離心管中加入的樣品溶液過(guò)多時(shí)，若再進(jìn)行渦旋操作，操作受阻，已吸附的待測(cè)物可以相對(duì)穩(wěn)定地吸附于萃取膜上，而渦旋提供的震蕩作用力足以減小吸附劑附近的濃差極化，使得吸附過(guò)程順利進(jìn)行。因此選擇樣品溶液體積為10 mL。

考察洗脫過(guò)程中解吸溶液體積(1、2、5 mL)對(duì)EPH響應(yīng)強(qiáng)度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)洗脫溶液體積為1 mL時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度最大，因此選擇洗脫劑體積為1 mL。

2.3.2 吸附過(guò)程、洗脫過(guò)程時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)分別考察了吸附時(shí)間(2、5、8、10 min)和洗脫時(shí)間(2、5、8、10、12 min)對(duì)結(jié)果的影響。發(fā)現(xiàn)當(dāng)吸附5 min，洗脫10 min時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度最高，因此選擇吸附時(shí)間5 min、洗脫時(shí)間10 min為實(shí)驗(yàn)最優(yōu)條件。

2.3.3 PVDF-PD-GO-SPE使用次數(shù)取“1.2.2”制備的EPH儲(chǔ)備溶液配成1.237 μg/mL質(zhì)量濃度的溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定，記錄IMS圖譜，然后使用甲醇和水各洗滌2次，重復(fù)操作。結(jié)果顯示，該P(yáng)VDF-PD-GO-SPE至少可以重復(fù)使用14次，第14次測(cè)定之后的萃取效率為初始值的96.9%～102%，其萃取效率無(wú)明顯變化，說(shuō)明該鍍層在萃取過(guò)程中具有良好的耐受性和穩(wěn)定性。

圖3 專屬性考察Fig.3 The results of specificity testA:blank urine sample,B:1.033 μg/mL standard solution,C:spiked 0.309 μg/mL sample solution

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性空白樣品溶液及0.309 μg/mL加標(biāo)樣品溶液按照“1.4”方法處理，進(jìn)樣，采集譜圖信息。如圖3所示，麻黃堿在(9.18±0.013)ms出峰。對(duì)比圖3A、B、C可知尿液基質(zhì)不干擾EPH的測(cè)定，分離良好，方法具有較強(qiáng)的專屬性。

2.4.2 線性關(guān)系、檢出限與定量下限取空白尿液，準(zhǔn)確配制成系列濃度的質(zhì)控樣品溶液，在優(yōu)化條件下測(cè)定并記錄IMS圖譜，以響應(yīng)強(qiáng)度(E)對(duì)其質(zhì)量濃度(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，EPH在0.124～6.129 μg/mL質(zhì)量濃度范圍與響應(yīng)強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，線性方程為E=0.581C+0.225(r2=0.988)。取最低點(diǎn)質(zhì)控樣品逐級(jí)稀釋，依次進(jìn)樣分析，以S/N=3和S/N=10時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別記為檢出限、定量下限，計(jì)算得麻黃堿的檢出限為9.60 ng/mL，定量下限為32.0 ng/mL。

2.4.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差取“1.2.3”制備的低(0.309 μg/mL)、中(1.273 μg/mL)、高(6.185 μg/mL) 3個(gè)濃度加標(biāo)樣品各3份，按照“1.4”方法處理后進(jìn)樣，以IMS中的峰面積計(jì)算回收率，得回收率為91.0%～113%，RSD為4.6%～8.5%。

2.4.4 實(shí)際樣品檢測(cè)健康受試者3人，一次性服用急支糖漿5 mL，服藥后5 h采集尿樣，在優(yōu)化條件下處理后進(jìn)樣測(cè)定，采集譜圖信息，得麻黃堿的質(zhì)量濃度分別為1.240(曲線1)、1.052(曲線2)、0.490(曲線3) mg/L，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 實(shí)際樣品檢測(cè)譜圖Fig.4 The spectra of real samples

2.5 與已有方法的比較

尿液中EPH的前處理方法主要包括液液萃取和固相萃取(表1)，但液液萃取需長(zhǎng)時(shí)間的萃取相平衡過(guò)程，且萃取劑與檢測(cè)手段不相符的還要進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換，操作繁瑣耗時(shí)；傳統(tǒng)的固相萃取要經(jīng)活化、淋洗、洗脫、溶劑轉(zhuǎn)換等繁瑣步驟，也不適用于EPH的快速檢測(cè)。本文建立的新型PVDF-PD-GO-SPE膜萃取方法，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，氧化石墨烯吸附劑可以特異性吸附EPH，且不需要長(zhǎng)時(shí)間的吸附過(guò)程，無(wú)需溶劑轉(zhuǎn)換，洗脫液可直接測(cè)定。

對(duì)比可知，PHR-IMS法的檢測(cè)靈敏度與色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相當(dāng)，相較于色譜法可以提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。PHR-IMS操作簡(jiǎn)單、大氣壓下即可操作、體積小便于攜帶、分析測(cè)定可在數(shù)秒內(nèi)完成的優(yōu)點(diǎn)為藥駕的快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，提供了可行性，奠定了基礎(chǔ)。

表1 前處理方法比較Table 1 The comparison of pretreatment methods

3 結(jié) 論

本文首次以聚偏氟乙烯為支撐載體，通過(guò)聚多巴胺結(jié)合氧化石墨烯吸附劑制成新型固相萃取模式，增大了吸附表面積，進(jìn)一步縮短了吸附時(shí)間、洗脫時(shí)間，操作簡(jiǎn)單、省時(shí)；將其與PHR-IMS結(jié)合可實(shí)現(xiàn)尿液中麻黃堿的快速檢測(cè)，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為藥駕在線檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)察提供了一種有效手段。