基于銅摻雜碳納米點(diǎn)熒光測(cè)定炭疽生物標(biāo)志物

華 鵬，黃 玉，周 陽(yáng)，何繁漪，楊瓊暉，朱為梅

(云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011)

細(xì)菌芽孢是產(chǎn)芽孢桿菌在孢內(nèi)形成的一種休眠體，對(duì)環(huán)境具有極強(qiáng)耐受性。炭疽芽孢是芽孢桿菌中的一種能致炭疽熱的危險(xiǎn)病原體，人類可通過食用或者吸入炭疽熱芽孢，皮膚接觸被感染的動(dòng)物，或者吸入已被細(xì)菌污染的物質(zhì)而被感染[1-2]。炭疽芽孢桿菌曾作為生化武器嚴(yán)重威脅人類的生命健康，所以準(zhǔn)確和靈敏地檢測(cè)炭疽芽孢對(duì)于預(yù)防和控制生物攻擊及疾病爆發(fā)十分重要[3-4]。2,6-吡啶二甲酸(Dipicolinic acid,DPA)是炭疽芽孢中的特有成分，約占芽孢干重的5%～15%，可通過孢子的物理、化學(xué)裂解或者萌芽等方式釋放。因此，DPA可作為炭疽芽孢桿菌中重要的生物標(biāo)志物用于炭疽芽孢的檢測(cè)[5-6]。近年來，炭疽芽孢桿菌的光學(xué)測(cè)定方法主要是利用鑭系金屬元素?zé)晒鈧鞲袑?duì)其中的DPA進(jìn)行檢測(cè)[7-8]，但是，鑭系金屬元素成本高，當(dāng)DPA濃度較低時(shí)熒光比色不明顯。因此，發(fā)展低成本且具備高靈敏度、高選擇性、低檢出限的DPA檢測(cè)方法仍是研究熱點(diǎn)。

熒光碳納米點(diǎn)(CDs)是一種尺寸小于10 nm，以碳為基本骨架，表面含有大量含氧基團(tuán)的單分散類球形納米顆粒[9-10]。與傳統(tǒng)有機(jī)染料及半導(dǎo)體量子點(diǎn)相比，熒光碳納米點(diǎn)不僅具有光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易于表面功能化和大規(guī)模制備等優(yōu)勢(shì)，還具有生物相容性好和細(xì)胞毒性低等特性[11-12]，在體內(nèi)外活體生物成像、熒光標(biāo)記、藥物傳輸、熒光探針等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[13-15]。近年來，有大量關(guān)于摻雜碳納米點(diǎn)的合成、性質(zhì)和應(yīng)用方面的研究報(bào)道，其中，金屬摻雜能夠在很大程度上改變碳納米點(diǎn)的電荷密度、光學(xué)及物理化學(xué)性質(zhì)，從而拓展其應(yīng)用范圍[16-17]。

本研究以檸檬酸、乙二胺為前體，硫酸銅為金屬摻雜劑，采用一步水熱法制備了一種穩(wěn)定的水溶性藍(lán)色發(fā)光銅摻雜碳納米點(diǎn)(Cu-CDs)，并基于酸性條件下DPA分子與銅離子產(chǎn)生的強(qiáng)螯合作用，實(shí)現(xiàn)了該Cu-CDs對(duì)DPA的特異性識(shí)別檢測(cè)。本方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、成本低，可用于炭疽生物標(biāo)志物的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

G9800A熒光分光光度計(jì)(美國(guó)安捷倫公司)，Tecnai G2TF30場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)，X-射線光電子能譜儀(XPS，賽默飛世爾科技公司)，TENSOR27型傅立葉紅外光譜分析儀(德國(guó)Bruker公司)，UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津公司)，Scilogex-MX-S漩渦混勻儀(北京開源國(guó)創(chuàng)科技有限公司)，120 mL聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene，PTFE)內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2,6-吡啶二甲酸標(biāo)準(zhǔn)品(DPA，純度>99%)購(gòu)于Sigma-Aldrich(上海)有限公司；苯甲酸、鄰苯二甲酸等有機(jī)小分子物質(zhì)以及六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)等無機(jī)鹽干擾物均購(gòu)自上海阿拉丁試劑有限公司；乙二胺、檸檬酸和磷酸氫二鈉(Na2HPO4)等試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用化學(xué)藥品及試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銅摻雜碳納米點(diǎn)(Cu-CDs)的制備準(zhǔn)確稱取3.0 g檸檬酸和2.0 g 硫酸銅溶解于97 mL的超純水中，超聲10 min形成淺藍(lán)色溶液，再加入3 mL乙二胺攪拌均勻，將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯水熱反應(yīng)釜中，于180 ℃下恒溫加熱5 h，反應(yīng)完成后自然冷卻至室溫，得到褐色溶液。將所得溶液過0.22 μm濾膜以除去大顆粒雜質(zhì)，然后用截留分子量為3 500 D的透析袋透析處理24 h，得到水溶性銅摻雜碳納米點(diǎn)(Cu-CDs)，并儲(chǔ)存于4 ℃下備用。

1.2.2 量子產(chǎn)率的測(cè)定將碳納米點(diǎn)配制成溶液后，測(cè)試其紫外-可見吸收光譜及熒光光譜(λex=350 nm)。將熒光強(qiáng)度值I及相應(yīng)的吸光度A(λem=440 nm)代入公式Φx=ΦR(nx/nR)2(AR/Ax)(Ix/IR)。式中，x為測(cè)試樣品，R為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；Φ表示熒光量子效率，n表示溶劑的折光率。實(shí)驗(yàn)中以硫酸奎寧(熒光量子效率為54%)作為標(biāo)準(zhǔn)物[18]。

1.2.3 測(cè)定方法稱取適量DPA，用超純水溶解，配制成不同濃度系列的DPA溶液。將上述制備好的Cu-CDs稀釋至2 mg/L，取Cu-CDs稀釋液1 mL于5 mL離心管中，加入不同濃度的DPA儲(chǔ)備液100 μL，用pH 6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol/L)定容至3 mL，渦旋混勻，靜置2 min，于激發(fā)波長(zhǎng)λex=348 nm，發(fā)射波長(zhǎng)λem=442 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度IF和試劑空白溶液熒光強(qiáng)度IF0。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳量子點(diǎn)的合成與表征

本實(shí)驗(yàn)以硫酸銅作為銅摻雜的反應(yīng)前體，經(jīng)一步水熱法制備了高熒光量子產(chǎn)率的水溶性Cu-CDs。圖1A為Cu-CDs的透射電鏡圖(TEM)，從圖中可以看出，所制備的碳納米點(diǎn)呈類球形結(jié)構(gòu)，分散性好，粒徑均勻，平均尺寸2～3 nm左右。

2.2 測(cè)定原理

如圖3所示，由于Cu-CDs中含有大量的銅摻雜離子，而DPA分子的羧基和吡啶氮是結(jié)合銅離子的作用位點(diǎn)，在酸性條件下，該作用位點(diǎn)能與銅離子產(chǎn)生較強(qiáng)的螯合作用。因此，在酸性體系中，當(dāng)在Cu-CDs溶液中加入DPA之后，Cu-CDs能與DPA分子迅速反應(yīng)，DPA分子通過與銅離子之間的螯合作用穩(wěn)定地結(jié)合在Cu-CDs表面上。這一螯合體系增強(qiáng)了Cu-CDs的π-π*共軛吸收，同時(shí)改變了熒光產(chǎn)生過程中的能級(jí)躍遷，在相同的激發(fā)波長(zhǎng)下，體系熒光發(fā)射波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移，因此，隨著DPA濃度增大，熒光紅移現(xiàn)象逐漸明顯，Cu-CDs的藍(lán)色熒光將逐漸減弱[19]。

圖3 銅摻雜碳納米點(diǎn)檢測(cè)DPA的原理示意圖Fig.3 Schematic illustration of the Cu-CDs for DPA detection

圖4 體系的選擇性實(shí)驗(yàn)Fig.4 Selectivity of fluorescence system1-15：0.15 μmol/L DPA;6 μmol/L of glucose,vitamin C,citric acid,sucrose,benzoic acid,phthalic acid,isophthalic acid,terephthalic acid,nicotinic acid,phenylalanine,cysteine,tryptophan,serine,the mixture of 0.15 μmol/L DPA with 6 μmol/L of different organic small molecules,respectively

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 pH值本實(shí)驗(yàn)選用50 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液作為緩沖體系，考察了pH值在2.0～8.0范圍內(nèi)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH 6.0時(shí)對(duì)體系熒光強(qiáng)度變化值的影響最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇 pH 6.0為最佳反應(yīng)pH值。

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間研究了反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光猝滅體系的影響。連續(xù)測(cè)定10 min，每隔1 min測(cè)定一次體系熒光強(qiáng)度變化值。結(jié)果顯示，體系熒光強(qiáng)度變化值在1～3 min內(nèi)逐漸增加，隨后趨于穩(wěn)定，故選擇3 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4 體系對(duì)DPA的選擇性

2.5 體系對(duì)DPA的響應(yīng)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，考察了Cu-CDs熒光猝滅程度與DPA濃度之間的關(guān)系。由圖5A可以看出，隨著DPA濃度的增加，Cu-CDs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱且光譜逐漸向綠色波長(zhǎng)移動(dòng)。DPA濃度(c)分別在5～100 nmol/L和150～400 nmol/L范圍內(nèi)與Cu-CDs熒光猝滅率(IF0-IF)/IF0(y)呈線性關(guān)系，線性回歸方程分別為y=0.005 5c+0.001 6和y=0.000 5c+0.572 3，相關(guān)系數(shù)分別為r2=0.994 1和r2=0.997 6，檢出限達(dá)2.3 nmol/L(S/N=3)。如圖5B所示，當(dāng)向Cu-CDs溶液中加入不同濃度的DPA時(shí)，隨著DPA濃度的增加，溶液在365 nm紫外燈下的顏色逐漸由藍(lán)色變?yōu)榫G色，故該探針可進(jìn)行比率測(cè)定。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

選取河水、自來水、牛奶以及小牛血清為分析對(duì)象，水樣先用0.22 μm濾膜過濾，再在15 000 r/min下離心10 min除去懸浮的大顆粒雜質(zhì)；牛奶經(jīng)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀法除去蛋白，取上清液過0.22 μm濾膜；10%的小牛血清無需處理。每個(gè)樣品平行測(cè)定5次，結(jié)果如表1所示，其加標(biāo)回收率為95.2%～105%，RSD為1.3%～3.8%。

表1 實(shí)際樣品中DPA含量的測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 1 Analytical results for DPA in real samples by the proposed method(n=5)

3 結(jié) 論

本研究制備了一種高穩(wěn)定性、高熒光量子產(chǎn)率的水溶性銅摻雜碳納米點(diǎn)(Cu-CDs)，基于炭疽芽孢生物標(biāo)志物2,6-吡啶二甲酸(DPA)與碳納米點(diǎn)中Cu2+的強(qiáng)螯合作用對(duì)Cu-CDs的藍(lán)色熒光猝滅及熒光顏色變化，建立了銅摻雜碳納米點(diǎn)比率測(cè)定炭疽生物標(biāo)志物的新方法。在最優(yōu)條件下，方法的檢出限達(dá)到2.3 nmol/L。該分析方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便，成本較低，具有良好的應(yīng)用前景。