石仙桃藥材HPLC指紋圖譜的建立及聚類分析Δ

張 淼，陳 龍，朱 華，黎 理，笪舫芳，龍 莉，何瑞婷（廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點實驗室，南寧530200）

石仙桃（Pholidota chinensisLindl.）為蘭科石仙桃屬植物石仙桃假的鱗莖或全草，又名石橄欖、石萸肉等[1]，具有養(yǎng)陰、清肺、利濕、消瘀的作用，可用于治療眩暈、頭痛、咳嗽、吐血、夢遺等疾病，民間常用其治療高血壓及其他原因引起的頭痛[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，石仙桃具有鎮(zhèn)靜、抗氧化、抗癌等活性，并對神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用[4-5]，如以其提取物制成的頭痛定糖漿可治療神經(jīng)性頭痛[6]。石仙桃作為常用壯藥之一[7]，主要分布于廣東、廣西、福建等地，其中以在廣西應(yīng)用較為廣泛。目前，市場上石仙桃藥材的品種混亂，導(dǎo)致其質(zhì)量參差不齊。本課題組前期對石仙桃進行了生藥學(xué)鑒別[8]及天麻素、多糖等的含量測定研究。在此基礎(chǔ)上，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）對來自不同產(chǎn)地的16批石仙桃藥材展開指紋圖譜研究，并進行聚類分析，為其質(zhì)量評價及進一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀、2489型紫外檢測器（美國Waters公司）；Agilent 1100型HPLC儀、G1315B型二級管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent公司）；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SQP型萬分之一電子天平[賽多利科學(xué)儀器（北京）有限公司]；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；H21-HST2106型紅外爐[美的（廣東）集團]；Milli-QAdvantage型A10純水儀（美國密理博有限責(zé)任公司）。

1.2 藥品與試劑

16批石仙桃藥材采自廣西、廣東及福建等地，樣品原植物采集后經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園高級園藝師朱意麟鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃（P.chinensisLindl.）的全草，采集到的藥材水焯5 min，45℃烘干，切段干燥，打粉過2號篩，備用；天麻素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201409，純度：91.9%）；甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、磷酸（色譜純）、醋酸（色譜純）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙腈、甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；水為超純水。藥材來源信息見表1。

表1 石仙桃藥材來源信息Tab 1 Source information of P.chinensis

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

2.2 溶液制備

2.2.1 天麻素對照品儲備液 精密稱取天麻素對照品6.12 mg，加水定容至25 mL量瓶中，即得。

2.2.2 供試品溶液 取16批藥材粉末（過二號篩）0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加入甲醇30 mL，稱質(zhì)量，回流提取30 min，再次稱質(zhì)量并補足質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液1 mL至1.5 mL離心管中，以13 000 r/min離心10 min，吸取上清液，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 取“2.2”項下天麻素對照品貯備液及供試品（編號S2）溶液，以甲醇為空白溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，天麻素的保留時間為7.554 min，與相鄰峰間分離度大于1.5，理論板數(shù)不低于5 000，且空白溶液不干擾檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性試驗考察結(jié)果Fig 1 Results of specificity tests

2.3.2 精密度試驗 取供試品（編號S2）溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批藥材（編號S2）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品（編號S2）溶液，分別于室溫下放置0、1、2、4、8、12、24 h后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以天麻素峰為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，11個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.0%（n＝7），表明供試品溶液室溫條件下放置24 h穩(wěn)定。

2.4 HPLC指紋圖譜的生成與相似度、共有峰的相關(guān)分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取16批藥材樣品各0.1 g，精密稱定，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)”（2012）版軟件分析，采用中位數(shù)法對相關(guān)參數(shù)進行自動匹配，標(biāo)定出藥材的11個共有峰，系統(tǒng)根據(jù)藥材共有模式生成石仙桃藥材的對照指紋圖譜R，并生成16批藥材的指紋圖譜。對照指紋圖譜R見圖2，16批藥材HPLC指紋圖譜共有模式見圖3。

圖2 藥材樣品HPLC對照指紋圖譜RFig 2 HPLC control fingerprint R of medicinal samples

圖3 16批藥材樣品HPLC指紋圖譜共有模式Fig 3 Common pattern of HPLC fingerprints for 16 batches of medicinal samples

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）分析軟件，以樣品S4的HPLC圖譜為對照，進行整體相似度評價。結(jié)果顯示，16批藥材樣品相似度均大于0.9，表明藥材樣品批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表3。

表3 16批石仙桃藥材指紋圖譜相似度評價結(jié)果Tab 3 Evaluation results of fingerprint similarity of 16 batches of P.chinensis

2.4.3 共有峰的指認及相關(guān)分析 16批藥材樣品有11個共有峰，通過與對照品比對，指認1號峰為天麻素，由于其分離良好、峰面積較大，且為所有藥材樣品共有，故設(shè)定其為參照峰（S），計算其他峰相對于11號峰的相對保留時間、相對峰面積，結(jié)果見表4、表5。

2.5 聚類分析

以16批藥材樣品11個共有峰的相對峰面積為原始數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 22.0軟件，采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進行聚類分析[9-10]。結(jié)果顯示，16批藥材樣品可聚為兩大類：S5、S16、S15、S9、S10、S8、S12、S1、S6、S4聚為一類；S2、S7、S14、S13、S3、S11聚為一類。16批石仙桃藥材的聚類分析圖見圖4。

3 討論

近年來，隨著人們健康意識的增強，利用中藥進行疾病預(yù)防和保健的需求逐年增高。藥材質(zhì)量成為健康市場關(guān)注的焦點，尋找有效的中藥質(zhì)量控制方法成為保證藥材質(zhì)量的最有效途徑。中藥指紋圖譜法利用其能夠顯示藥材多種成分含量，并能特征性地表達中藥成分復(fù)雜性的特殊優(yōu)勢成為當(dāng)前最有效、最快捷的常用中藥質(zhì)量控制與評價方法。鑒于此，本課題組從整體角度出發(fā)，采用HPLC指紋圖譜方法分析石仙桃藥材所含的多種化學(xué)物質(zhì)，為石仙桃藥材質(zhì)量控制與評價提供了實驗基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

構(gòu)建指紋圖譜需要樣品具有多個分離度較好的色譜峰，因而樣品的制備就顯得尤為重要。中藥含有多種化學(xué)成分，選用不同提取方法提取出來的成分種類或含量就會有所差異，尤其在微量成分方面，因而也會影響到后期指紋圖譜的構(gòu)建。筆者通過前期文獻研究，初步考察了供試品制備過程中的提取方法（超聲提取和加熱回流），提取溶劑（水、甲醇、乙醇），溶劑用量（20、30、40 mL）以及提取時間（15、30、45 min）等因素，以HPLC指紋圖譜所含共有峰的種類、分離度、峰面積總和等作為評價指標(biāo)，最終確定了石仙桃供試品制備的最佳提取工藝：藥材粗粉0.1 g，加入甲醇30 mL，加熱回流提取30 min。

表4 16批石仙桃藥材共有峰的相對保留時間Tab 4 Relative retention time of common peak of 16 batches of P.chinensis

表5 16批石仙桃藥材共有峰的相對峰面積Tab 5 Relative peak area of common peak of 16 batches of P.chinensis

圖4 16批石仙桃藥材的聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of 16 batches of P.chinensis

前期，筆者分別考察了不同色譜柱[Agilent ZORBAX SB-aq（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同的流動相系統(tǒng)（乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.05%磷酸水溶液、甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%醋酸水溶液、甲醇-0.05%醋酸水溶液），不同柱溫（20、25、30、35 ℃），不同進樣量（5、10、15 μL）以及不同流速（0.8、1.0、1.3 mL/min）等色譜條件，最終確定了石仙桃指紋圖譜的色譜柱為Agilent SB-aq(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，進樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min。

聚類分析作為一種劃分未知類別的分析方法，常用于中藥品種和質(zhì)量分析研究中。但其作為常用的探索性分析，在分類的過程中，采用構(gòu)建方法不同、選取的參照標(biāo)準(zhǔn)不同、樣本數(shù)據(jù)不同，分類的結(jié)果和結(jié)論也會不同。由于樣本量的限制及變量類型等不同，本研究采用系統(tǒng)聚類法對16批次石仙桃藥材指紋圖譜進行了聚類分析，并將其聚為兩大類：S2、S7、S14、S13、S3、S11聚為一類，另外幾批藥材聚為一類。其聚類結(jié)果與藥材假鱗莖的大小及藥材的生長年限存在一定的關(guān)聯(lián)度，S2、S7、S14、S13、S3、S11幾個批次藥材假鱗莖較大，生長年限長，也可能是由于藥材的產(chǎn)地、采收季節(jié)[11-12]等原因造成了其差異較大。