HPLC法測定福多司坦原料藥及其制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量Δ

郭志淵，趙欣慶，朱恒怡，袁 軍（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，成都 611731）

福多司坦于1988年由日本SS制藥株式會(huì)社研發(fā)創(chuàng)制，1990年與同仁醫(yī)藥化工株式會(huì)社開展臨床試驗(yàn)[1-2]，2001年12月7日首次在日本上市[3]。福多司坦作為一類高效祛痰藥物[4]，應(yīng)用前景較好。目前，國內(nèi)制備福多司坦原料藥的工藝有2種，一種是鹽酸半胱氨酸與烯丙醇反應(yīng)制得[5]，另一種是鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應(yīng)制得[6]。國內(nèi)上市的福多司坦口服固體制劑有片劑、膠囊劑及顆粒劑。

在福多司坦原料藥及其制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)[7-9]中，有關(guān)物質(zhì)檢測方法雖各不相同，但均僅控制了未知雜質(zhì)及福多司坦右旋異構(gòu)體。然而，根據(jù)化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[10]要求，無論原料或制劑含量大于鑒定閾值的雜質(zhì)都應(yīng)進(jìn)行鑒定，明確雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)并對其限度進(jìn)行研究。在2018年仿制藥一致性評(píng)價(jià)中，為了區(qū)分福多司坦各仿制藥工藝的差異及質(zhì)量的優(yōu)劣，筆者收集了相關(guān)文獻(xiàn)[11-14]報(bào)道的福多司坦中的檢測出的有關(guān)雜質(zhì)，如半胱氨酸（雜質(zhì)A）、胱氨酸（雜質(zhì)B）、福多司坦亞砜（雜質(zhì)C）、（2R，2'R）-3，3'-（丙基-1，3-二硫代）雙（二氨基丙酸）（雜質(zhì)E）、（-）-（R）-2-（3-羥丙基）氨基-3-（3-羥丙基硫代）丙酸（雜質(zhì)F）、（-）-（R）-2-氨基-3-（3-氯丙基硫代）丙酸（雜質(zhì)G），并采用高效液相色譜（HPLC）外標(biāo)法及加校正因子的主成分自身對照法對福多司坦原料藥及其仿制藥生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的片劑、膠囊劑中的這些雜質(zhì)進(jìn)行定量分析，以期為福多司坦仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供參考。福多司坦及其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 福多司坦及其雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Structures of fudosteine and its impurities

1 材料

1.1 儀器

2695 HPLC儀（美國Waters公司）；1260 HPLC儀（美國Agilent公司）；CPA225D電子天平、A8000多參數(shù)測量酸度計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

福多司坦對照品（批號(hào)：100920-201802，純度：99.5%）、雜質(zhì)B對照品（批號(hào)：140632-200502，純度：99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)A對照品（加拿大TRC公司，批號(hào)：2-MJJ-156-1，純度：97.0%）；雜質(zhì)C對照品（美國CRTO公司，批號(hào)：C4X-14471-1709，純度：98.7%）；雜質(zhì)E對照品（批號(hào)：WS-T170608X，純度：95.9%）、雜質(zhì)F對照品（批號(hào)：WS-T170110Z-1，純度：95.6%）、雜質(zhì)G對照品（批號(hào)：ES7818-4-P1，純度：94.4%）均由本實(shí)驗(yàn)室自制；福多司坦原料藥1（A企業(yè)，批號(hào)：FD160871，純度：99.2%）；福多司坦原料藥2（批號(hào)：160806008，純度：99.9%）、福多司坦膠囊2（批號(hào)：160910056，規(guī)格：0.2 g）均購自B企業(yè)；福多司坦原料藥3（批號(hào)：H160404，純度：99.4%）、福多司坦片1（批號(hào)：B160201161，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦膠囊 1（批號(hào)：1607001，規(guī)格：0.2 g）均購自C企業(yè)；福多司坦原料藥4（D企業(yè)，批號(hào)：160309-1，純度：99.1%）；福多司坦原料藥5（批號(hào)：1610001，純度：99.9%）、福多司坦片2（批號(hào)：057170101，規(guī)格：0.2 g）均購自E企業(yè)；福多司坦片3（F企業(yè)，批號(hào)：1607201，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦片4（G企業(yè)，批號(hào)：160702，規(guī)格：0.2 g）、福多司坦膠囊3（H企業(yè)，批號(hào)：1606003，規(guī)格：0.2 g）；己烷磺酸鈉、乙腈為色譜純，磷酸、磷酸二氫鉀等為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜條件1（用于檢測雜質(zhì)A、B、C）：色譜柱為MGⅡC18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.12%己烷磺酸鈉溶液（pH 2.0），流速為1.0 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為20 μL。

色譜條件2（用于檢測雜質(zhì)E、F、G和其他未知雜質(zhì)）：色譜柱為Altech Altima C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（A）-乙腈（B）-水（C），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長為200 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 雜質(zhì)對照品溶液的制備 （1）雜質(zhì)A、B、C混合對照品溶液：精密稱取雜質(zhì)A、B、C對照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液溶解并稀釋制成各雜質(zhì)質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的對照品溶液。（2）福多司坦及雜質(zhì)E、F、G混合對照品溶液：精密稱取福多司坦對照品及雜質(zhì)E、F、G對照品適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成福多司坦及雜質(zhì)E、F、G質(zhì)量濃度均為100 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取福多司坦原料藥或其制劑內(nèi)容物100 mg，分別置于50 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為供試品溶液1、2。

2.2.3 自身對照溶液的制備 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液0.1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，分別作為自身對照溶液1、2。

2.2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液 取福多司坦及雜質(zhì)A、B、C對照品適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質(zhì)A、B、C各2 μg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液1；取福多司坦與雜質(zhì)E、F、G對照品適量，加“2.1”項(xiàng)下0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液制成每1 mL含福多司坦2 mg和雜質(zhì)E、F、G各2 μg的溶液作為系統(tǒng)適用性溶液2。

2.2.5 空白輔料溶液 將各廠家福多司坦片、膠囊的輔料按配方量混合，并稱取相當(dāng)于最大片質(zhì)量1/2的輔料量置于50 mL量瓶中，分別用0.12%己烷磺酸鈉溶液或0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解作為空白輔料溶液1、2。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2.4”項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液1、2，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，空白輔料峰無干擾，福多司坦峰與各雜質(zhì)峰間無干擾，分離度均＞1.5，各雜質(zhì)峰理論板數(shù)均＞3 000，雜質(zhì)E、F、G的相對保留時(shí)間為0.88、1.95、3.08。系統(tǒng)適用性色譜圖見圖2。

圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatograms of system suitability test

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 取福多司坦片（批號(hào)：B160201161），研磨成細(xì)粉，取福多司坦粉末100 mg，分別置于50 mL量瓶中，共6份，一份為未破壞樣品，另5份按以下條件進(jìn)行破壞。（1）酸破壞：加1 mol/L鹽酸溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為酸破壞樣品。（2）堿破壞：加1 mol/L氫氧化鈉溶液5 mL，水浴加熱30 min，放冷后，加1 mol/L鹽酸溶液5 mL中和，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為堿破壞樣品。（3）高溫破壞：加水適量溶解后，置于105 ℃下加熱30 min，然后用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為高溫破壞樣品。（4）光照破壞：加水適量溶解后，置于紫外燈（波長254 nm）下照射2 d后，用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為光照破壞樣品。（5）氧化破壞：加10%過氧化氫溶液1 mL，立即用水稀釋至刻度，搖勻，濾過，續(xù)濾液作為氧化破壞樣品。取上述6種樣品20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，在不同破壞條件下，各降解產(chǎn)物峰均能與主峰完全分離，表明該方法專屬性良好。專屬性試驗(yàn)色譜圖見圖3。

2.3.3 線性關(guān)系及校正因子考察 分別取“2.2.1（1）”項(xiàng)下對照品溶液適量，加0.12%己烷磺酸鈉溶液稀釋制成每1 mL中含雜質(zhì)A、B、C均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg的系列溶液；另取“2.2.1（2）”項(xiàng)下對照品溶液適量，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋制成每1 mL中含福多司坦和雜質(zhì)E、F及G均為0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 μg的系列溶液。精密吸取上述溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以福多司坦或各雜質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，并以方程斜率（K）計(jì)算雜質(zhì)E、F、G的校正因子（校正因子＝K福多司坦/K雜質(zhì)E/F/G），線性關(guān)系及校正因子考察結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系及校正因子Tab 2 Linear relationships and correction factors

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.3.3”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的各雜質(zhì)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄福多司坦及各雜質(zhì)的峰面積。結(jié)果，福多司坦及各雜質(zhì)峰面積的RSD均小于1.2%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.3.5 檢測限與定量限考察 取“2.2.1”項(xiàng)下福多司坦及各雜質(zhì)的對照品溶液，逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析。以信噪比為3∶1計(jì)算檢測限，以信噪比為10∶1計(jì)算定量限。結(jié)果，福多司坦及雜質(zhì)A、B、C、E、F、G的檢測限分別為2.06、5.57、1.01、1.99、2.22、4.21、4.43 ng，定量限分別為4.12、11.14、2.02、3.98、4.45、8.42、8.85 ng。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 3 Chromatograms of specific test

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.4”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、24 h后按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A在4 h內(nèi)峰面積的RSD＜2.0%（n＝3），福多司坦及雜質(zhì)B、C、E、F、G在24 h內(nèi)峰面積的RSD均＜1.0%（n＝7），表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下各雜質(zhì)混合對照品溶液適量，置于已稱有一定空白輔料和福多司坦原料藥5的量瓶中，制備相當(dāng)于雜質(zhì)含量20%、100%、150%的供試品溶液，每個(gè)濃度各3份，取上述供試品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積，雜質(zhì)A、B、C按外標(biāo)法計(jì)算各雜質(zhì)回收率，雜質(zhì)E、F、G按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算各雜質(zhì)加樣回收率。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、E、F、G平均加樣回收率分別為98.0%、97.3%、102.4%、99.4%、98.9%、96.4%，RSD分別為1.4%、1.5%、1.1%、0.9%、1.2%、0.5%（n＝9）。

2.3.8 樣品中各雜質(zhì)含量檢測 分別取各生產(chǎn)企業(yè)的原料藥或制劑樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，然后取該樣品溶液按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備自身對照溶液，然后取上述溶液適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件1、2進(jìn)樣分析，記錄峰面積。雜質(zhì)A、B、C按外標(biāo)法計(jì)算其在樣品中的含量，雜質(zhì)E、F、G按加校正因子的主成分自身對照法計(jì)算其在樣品中的含量，由于樣品中還有其他未知雜質(zhì)，因此，筆者采用自身對照法[15]對其他未知雜質(zhì)含量進(jìn)行測定。樣品中各雜質(zhì)含量檢測結(jié)果見表3。

表3 樣品中各雜質(zhì)含量檢測結(jié)果（%%）Tab 3 Results of content determination of the impurities in samples（%%）

3 討論

3.1 色譜系統(tǒng)選擇

福多司坦各雜質(zhì)極性相差較大，其中雜質(zhì)A、B、C的極性較大，在低pH的0.12%己烷磺酸鈉溶液中能夠得到良好分離，但在該色譜條件1下無法將極性較小的雜質(zhì)E、F、G洗脫出來，故使用極性較小的色譜條件2對其進(jìn)行分離。福多司坦右旋異構(gòu)體在標(biāo)準(zhǔn)中有檢測方法，因此，本文沒有再進(jìn)行研究。

3.2 雜質(zhì)來源分析

福多司坦中雜質(zhì)A為起始物料，雜質(zhì)B為起始物料中的雜質(zhì)或降解產(chǎn)物，雜質(zhì)E、F、G為反應(yīng)副產(chǎn)物，其中雜質(zhì)G為鹽酸半胱氨酸與3-鹵代-1-丙醇反應(yīng)的特定副產(chǎn)物，雜質(zhì)C為福多司坦氧化降解產(chǎn)物。由強(qiáng)制降解試驗(yàn)可知，福多司坦的主要降解產(chǎn)物為雜質(zhì)C，在堿降解中還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)較大的未知降解雜質(zhì)，但因樣品中均未檢出這幾個(gè)雜質(zhì)，且未制備有相應(yīng)的對照品，所以此次試驗(yàn)未對這幾個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行定量研究。

3.3 雜質(zhì)的限度

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在福多司坦原料藥及其制劑中，雜質(zhì)C、E和G含量較高，約0.1%～0.2%。福多司坦制劑每日最大服用劑量為1.2 g，各雜質(zhì)為非毒性雜質(zhì)，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[10]，建議將工藝雜質(zhì)A、B、E、F、G限度定為0.15%，降解雜質(zhì)C可適當(dāng)放寬限度，其他單個(gè)未知雜質(zhì)限度定為0.1%，雜質(zhì)總量限度定為1.0%。

綜上所述，不同企業(yè)福多司坦原料藥中雜質(zhì)含量存在差異，從而使得其各制劑中有關(guān)物質(zhì)的含量參差不齊。因此，建議仿制藥企業(yè)完善福多司坦原料藥有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，為其仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)。