超濾法結合UPLC-MS/MS法研究樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的血漿蛋白結合率Δ

班玉娟，張麗，陳瑞，朱高峰，，王建塔，，陳文章，湯磊，，黃靜#（.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽550004；.貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術研究中心，貴陽 550004）

樹豆酮酸A（Cajanonic acidA）是從樹豆葉中分離出來的一種新的菧類化合物。已有體內(nèi)和體外研究表明，樹豆酮酸A具有降血糖活性[1]，可促進人肝癌細胞HepG2對葡萄糖的消耗[2]，可通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（Protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）和相關胰島素信號因子的表達來恢復胰島素信號的轉導，能有效降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖、血清總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇水平，能保護器官免受損傷[3]；此外，樹豆酮酸A還可以抑制脂肪細胞分化并降低各種脂肪形成相關mRNA的基因水平[4]。由此可見，樹豆酮酸A是一個潛在的可開發(fā)用于治療2型糖尿病或肥胖癥的藥物。

藥物血漿蛋白結合率是指藥物吸收后與血漿中所有蛋白結合的量占藥物總量的百分比，是藥動學的重要參數(shù)之一，藥物與血漿蛋白的結合作用影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，從而影響其藥理效應[5]。藥物被吸收后，只有沒有與血漿蛋白結合的游離藥物才能通過生物膜并作用于靶器官發(fā)揮藥理作用，因此測定藥物與血漿蛋白的結合率在新藥研發(fā)及臨床研究中非常重要[6]。研究藥物血漿蛋白結合率的方法有微透析法、平衡透析法、超濾法、超速離心法等[7]，本研究采用超濾法聯(lián)合超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）法分別測定低、中、高3個質量濃度（2.5、5、20 μg/mL）的樹豆酮酸A在大鼠、家兔及健康人血漿中的蛋白結合率，以期為樹豆酮酸A的后期藥效學、藥理學和臨床研究提供依據(jù)。樹豆酮酸A的化學結構見圖1。

圖1 樹豆酮酸A的化學結構Fig1 Chemical structure of cajanonic acidA

1 材料

1.1 儀器

Xevo G2-XS型UPLC-四級桿串聯(lián)飛行時間質譜儀，配有MassLynx V4.1質譜工作站、UNIFI 7.0數(shù)據(jù)庫（美國Waters公司）；Amicon Ultra-0.5型超濾離心管（美國Millipore公司，截留相對分子量：10 000）；pHS-3C型酸度計（上海雷磁儀器廠）；ThermoShaker R制冷型恒溫混勻儀（北京昊諾斯科技有限公司）；JN300-2型氮氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司）；X1型高速離心機（香港基因有限公司）；FA805N型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋[邦西儀器科技（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

樹豆酮酸A對照品[由貴州醫(yī)科大學藥物化學重點實驗室制備，批號：20181226，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）和核磁結構鑒定，純度：＞98%]；健康人血漿（由貴州省血液中心提供，批號：20180608，許可證號：07001）；磷酸鹽緩沖液（PBS）干粉（北京索萊寶科技有限公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯和甲酸均為色譜純，水為實驗室自制超純水，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，♀♂各半，體質量200～230 g，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（湘）2014-0011；SPF級新西蘭白兔，♀♂各半，體質量2.0～2.5 kg，實驗動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（湘）2014-0010。所有動物均購自長沙市天勤生物技術有限公司。

2 方法

2.1 血漿的采集

2.1.1 大鼠血漿 取SD大鼠，♀♂各半，股動脈取血，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，立刻于4℃、3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，－20℃冷凍貯存。

2.1.2 家兔血漿 取家兔，♀♂各半，心臟取血，置于裝有肝素鈉溶液的EP管中，立刻于4℃、3 500 r/min離心10 min，分離上層血漿，－20℃冷凍貯存。

2.2 溶液的制備

2.2.1 PBS 精密稱取PBS干粉2.24 g，置于200 mL量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.01 mol/L、pH 7.4的PBS，于4℃貯存，備用。

2.2.2 樹豆酮酸A貯備液 精密稱取樹豆酮酸A對照品25.00 mg，置于25 mL量瓶中，加少量甲醇，超聲（功率：600 W，頻率：40 kHz）10 min使其溶解，再以pH 7.4的PBS定容，搖勻，即得1 mg/mL的樹豆酮酸A貯備液。

2.3 樣品預處理

取“2.6”項下超濾液與孵育液各100 μL分別置于EP管中，加入600 μL甲醇，渦旋混勻5 min后，以12 000 r/min離心10 min（均在4℃下進行）。取上清液于37℃下氮氣吹干，加入400 μL蒸餾水與600 μL乙酸乙酯復溶，渦旋混勻5 min后，萃取，靜置分層后取上層液于37℃下氮氣吹干，再以100 μL甲醇復溶，12 000 r/min離心10 min，取上清液適量進樣分析。

2.4 色譜條件與質譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；保護柱為 WatersVanGuard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）；流動相為0.01%甲酸溶液（溶劑A）和含0.01%甲酸的乙腈溶液（溶劑B），梯度洗脫（0～0.5 min，30%B；0.5～2 min，30%→98%B；2～3 min，98%B；3～5 min，98%→30%B；流速為0.15 mL/min）；柱溫為30 ℃；進樣量為2 μL。

2.4.2 質譜條件 電噴霧電離源（ESI）；負離子模式采集（Negative）；毛細管電壓為1.5 kV；錐孔電壓為30 V；離子源溫度為100℃；脫溶劑氣溫度為400℃；錐孔氣流量為50 L/h；脫溶劑氣流量為800 L/h；掃描范圍為質荷比（m/z）50→1 200；數(shù)據(jù)采集分析軟件為Masslynx V 4.1；數(shù)據(jù)采集模式為全掃描。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性 分別取大鼠、家兔及人血漿，按照“2.3”項下方法進行處理，制成3個種屬的空白血漿樣品；取樹豆酮酸A貯備液分別以大鼠、家兔及人血漿稀釋后，按照“2.3”項下方法進行處理，制成3個種屬的樹豆酮酸A血漿樣品；取樹豆酮酸A對照品以甲醇溶解，制成樹豆酮酸A對照品溶液；取大鼠、家兔及人血漿孵育液及超濾液各100 μL，按照“2.3”項下方法進行處理，制成不同種屬的孵育液及超濾液樣品。處理后的樣品及對照品按照“2.4”項下條件進行UPLC-MS/MS測定，考察該方法專屬性。

2.5.2 線性關系、定量下限與檢測限 精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，用PBS逐一稀釋制成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、26 μg/mL系列質量濃度的溶液，每個質量濃度取50 μL，平行3份，分別加入大鼠、家兔及人血漿950 μL，渦旋混勻1 min，置于37℃水浴中60 min后，各取100 μL按照“2.3”項下方法進行處理，再按照“2.4”項下條件進行UPLC-MS/MS測定，記錄峰面積。以樹豆酮酸A的峰面積為縱坐標（y）、樹豆酮酸A質量濃度為橫坐標（x，μg/mL）進行線性回歸。以線性范圍下限為定量下限，以信噪比3∶1對應的質量濃度為檢測限。

2.5.3 精密度與回收率 參考文獻[8]中方法，精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，以PBS稀釋后，各取50 μL，分別加入大鼠、家兔及人血漿950 μL，制成質量濃度分別為2.5、5、20 μg/mL的樹豆酮酸A質控（QC）血漿樣品，取100 μL按照“2.3”項下方法進行處理，再按照“2.4”項下條件進行UPLC-MS/MS測定，記錄峰面積，平行5份，每日測5次，考察日內(nèi)精密度，并將峰面積代入回歸方程計算樹豆酮酸A濃度，以測得濃度/理論濃度×100%計算回收率；連續(xù)進樣5 d，考察日間精密度。

2.5.4 基質效應 按“2.5.3”項下方法制備低、中、高質量濃度（2.5、5、20 μg/mL）3個種屬的樹豆酮酸A QC血漿樣品（平行6份），按照“2.3”項下方法進行處理，再按照“2.4”項下條件進行UPLC-MS/MS測定，測得峰面積（A1）。另以甲醇配制相同低、中、高質量濃度的樹豆酮酸A的QC樣品（不含基質，平行6份），按照“2.4”項下條件進行UPLC-MS/MS測定，測得峰面積（A2），以A1/A2計算基質效應。

2.5.5 穩(wěn)定性 按“2.5.3”項下方法制備低、中、高質量濃度（2.5、5、20 μg/mL）3個種屬的樹豆酮酸A QC血漿樣品，將樣品分別放置于冰箱冷藏（4℃）、室溫（約20℃）、孵育溫度（37℃）條件下12 h和反復凍融（4℃冷凍，37 ℃融化）3次后，按照“2.3”項下方法處理，再按照“2.4”項下方法進行UPLC-MS/MS測定，平行5份，考察其穩(wěn)定性。

2.6 血漿蛋白結合率測定

參考文獻[9]中方法，精密量取一定量的1 mg/mL樹豆酮酸A貯備液，以PBS分別稀釋制成50、100、400 μg/mL 3個質量濃度的樹豆酮酸A溶液，備用。取相應樹豆酮酸A溶液50 μL（每個質量濃度平行3份），分別加入950 μL大鼠、家兔及人血漿，渦旋混勻，制成2.5、5、20 μg/mL的樹豆酮酸A血漿樣品。將其置于37℃恒溫水浴中孵育60 min，得孵育液。將孵育液取出置于冰上（保持低溫4℃左右），移500 μL至超濾管中，于低溫冷凍離心機中，在4℃、12 000 r/min下離心20 min，得超濾液。取孵育液及超濾液各100 μL按照“2.3”項下方法進行處理，分別取上清液按照“2.4”項下條件進行UPLCMS/MS測定，代入回歸方程算得孵育液和超濾液中樹豆酮酸A的質量濃度，根據(jù)公式（1）計算血漿蛋白結合率：

式中，c孵育液表示超濾前孵育液中樹豆酮酸A的質量濃度（μg/mL）；c超濾液表示超濾液中樹豆酮酸A的質量濃度（μg/mL）。將實驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，分別對同種種屬中不同質量濃度之間樹豆酮酸A的血漿蛋白結合率進行單因素方差分析，不同種屬之間樹豆酮酸A的血漿蛋白結合率進行獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1 專屬性 大鼠、家兔和人3個種屬間的空白血漿樣品、樹豆酮酸A血漿樣品及其孵育液、超濾液樣品經(jīng)處理后進樣得到的色譜圖基本一致，因此以人血漿為基質制備的樣品所得色譜圖作為代表圖，省略以大鼠血漿與家兔血漿為基質制備的樣品色譜圖?？瞻兹搜獫{樣品、樹豆酮酸A對照品、加入樹豆酮酸A的人血漿樣品、樹豆酮酸A人血漿孵育液及超濾液樣品的色譜圖見圖2。

圖2 總離子流圖Fig 2 TIC chromatogram

由圖2所示，該檢測方法下，樹豆酮酸A的保留時間為1.25 min，在進樣0.75～2.00 min之間只有樹豆酮酸A的色譜峰較明顯，無其余相鄰干擾峰，且空白血漿樣品的1.25 min位置上沒有出現(xiàn)色譜峰，該方法專屬性良好。3.1.2 線性關系、定量下限與檢測限 結果表明，該檢測方法下，樹豆酮酸A在0.05～26 μg/mL質量濃度范圍內(nèi)線性關系良好（r均＞0.999 5），定量下限為0.05 μg/mL，檢測限為0.01 μg/mL。樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的回歸方程及線性范圍見表1。

表1 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的線性關系Tab 1 Results of linear relationship of cajanonic acid A

3.1.3 精密度與回收率 結果表明，樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的回收率為（86.03±2.36）%～（103.80±1.32）%，日內(nèi)和日間RSD均＜10%（n＝5），符合生物樣品分析方法要求。精密度與回收率結果見表2。3.1.4 基質效應 結果表明，樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的基質效應為（91.16±5.89）%～（104.70±4.73）%，可見該方法基質效應小，具有特異、專屬地測定分析該待測物的能力?；|效應結果見表3。

表2 精密度與回收率結果（n＝5）Tab 2 Results of precision and recovery（n＝5）

表3 基質效應結果（±s，n＝6）Tab 3 Results of matrix effects（±s，n＝6）

表3 基質效應結果（±s，n＝6）Tab 3 Results of matrix effects（±s，n＝6）

血漿樣品大鼠家兔人基質效應，%2.5 μg/mL 92.42±5.42 101.30±6.11 91.26±5.89 5 μg/mL 104.70±4.73 96.54±4.29 99.62±4.26 20 μg/mL 98.39±5.24 103.50±4.86 102.10±3.63

3.1.5 穩(wěn)定性 結果表明，穩(wěn)定性試驗中含量的RSD均＜10%（n＝5），可見該方法穩(wěn)定性較好，符合生物樣品分析方法要求。穩(wěn)定性試驗結果見表4。

表4 穩(wěn)定性試驗結果（n＝5）Tab 4 Results of stability tests（n＝5）

3.2 血漿蛋白結合率

結果表明，不同質量濃度的樹豆酮酸A在同一種屬血漿中的血漿蛋白結合率差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），中、高質量濃度的樹豆酮酸A與同一種屬血漿的血漿蛋白結合率高于低質量濃度。在低質量濃度時，樹豆酮酸A在大鼠血漿與人血漿中的血漿蛋白結合率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），均低于在家兔血漿中的血漿蛋白結合率（P＜0.05）；在中、高質量濃度時，樹豆酮酸A在3個種屬血漿中血漿蛋白結合率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結合率見表5。

表5 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結合率（±s，n＝3）Tab 5 Protein binding rate of cajanonic acid A with different species of plasma（±s，n＝3）

表5 樹豆酮酸A在不同種屬血漿中的蛋白結合率（±s，n＝3）Tab 5 Protein binding rate of cajanonic acid A with different species of plasma（±s，n＝3）

注：與家兔比較，＊P＜0.05Note：vs.rabbits，＊P＜0.05

血漿樣品大鼠家兔人血漿蛋白結合率，%20 μg/mL 99.42±0.01 99.42±0.03 99.37±0.01 2.5 μg/mL 75.63±0.90＊79.61±1.08 76.74±1.22＊5 μg/mL 98.30±0.03 98.48±0.10 97.99±0.11

4 討論

研究藥物血漿蛋白結合率的方法有多種，其中超濾法和平衡透析法是較為經(jīng)典、常用的方法[10]。平衡透析法是研究藥物血漿蛋白結合率的經(jīng)典方法，該法較簡單、經(jīng)濟、受實驗因素干擾小，但平衡透析法有透析平衡時間較長（通常37℃靜置透析需要12～48 h達擴散平衡）、極易受血漿和緩沖液的pH影響以及透析設備表面可能會非特異性藥物吸附效應等缺點[11]。而超濾法操作簡便、測定快速、生物樣品量少，能減少設備表面非特異性的吸附，考慮到以上原因，本研究選擇超濾法測定樹豆酮酸A的血漿蛋白結合率。此外，孵育液中混有磷酸鹽及蛋白、超濾液中可能殘余有磷酸鹽及少量蛋白，會堵塞離子阱質譜的傳輸毛細管，因此采用甲醇沉淀蛋白法，再用乙酸乙酯萃取對其進行前處理。樹豆酮酸A在4℃、室溫及37℃下12 h內(nèi)皆穩(wěn)定，RSD均＜10%，因此在37℃下孵育及用氮氣將其吹干對實驗結果無影響。預實驗考察過樹豆酮酸A血漿樣品在37℃下孵育60 min，樹豆酮酸A與血漿蛋白的結合已達到平衡狀態(tài)。還應注意，用pH 7.4的PBS制備的樹豆酮酸A應該即配即用，以防止因久置而使樹豆酮酸A在PBS中發(fā)生轉化。

本研究采用超濾法結合UPLC-MS/MS法測定2.5、5、20 μg/mL 3個質量濃度的樹豆酮酸A在大鼠、家兔和人血漿中的血漿蛋白結合率，質量濃度為2.5 μg/mL時，在大鼠、家兔和人血漿的蛋白結合率分別為（75.63±0.90）%、（79.61±1.08）%、（76.74±1.22）%；質量濃度為5 μg/mL時的血漿蛋白結合率均在98%左右；質量濃度為20 μg/mL時的血漿蛋白結合率均在99%左右。結果表明，各質量濃度樹豆酮酸A與人血漿和大鼠血漿的蛋白結合率皆無明顯差異，但在低質量濃度時在家兔血漿中的蛋白結合率明顯高于大鼠和人。在新藥研發(fā)早期階段，可通過表征其在體外血漿蛋白結合率的情況，對實驗動物與人進行不同種屬間的結合率差異比較研究，為動物實驗結果外推至人體提供有益參考。本研究為進一步的臨床前藥效、藥動和毒理研究中模型動物的選擇提供了參考依據(jù)。

樹豆酮酸A與血漿蛋白的結合具有濃度依賴性，藥物濃度升高其血漿蛋白結合率隨之升高，藥物高濃度時結合率達到99%以上，這可能與藥物的理化性質及血漿蛋白的結合性質有關。具有濃度依賴性或高血漿蛋白結合的藥物臨床使用需注意控制劑量，防止因藥物與血漿蛋白結合而達不到有效血藥濃度，更需注意的是，高血漿蛋白結合的藥物臨床使用易產(chǎn)生安全性問題，一旦有影響血漿蛋白結合的因素產(chǎn)生，例如與其他高血漿蛋白結合率藥物聯(lián)合用藥時，游離藥物濃度則可能成倍增加，造成藥物副作用或毒性[12]。本研究結果顯示，樹豆酮酸A有很強的血漿蛋白結合率，所以在接下來的研究中需選擇在臨床有可能聯(lián)合用藥的高血漿蛋白結合率藥物進行體外藥物競爭結合試驗[13]，以考察其對樹豆酮酸A蛋白結合率的影響，保證人體用藥安全。