放線菌KN37菌株代謝物對番茄灰霉病的防治

邵勝楠，張安琪，巴爾那·庫馬爾，張國強

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院 / 新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆 石河子832003)

番茄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)引起的一種重要的世界性番茄病害，該病害主要危害果實，造成果實腐爛，也可危害葉、莖和花，造成嚴重減產(chǎn)，產(chǎn)量損失高達20%～50%[1]。番茄灰霉病可通過氣流、雨水、昆蟲等方式進行多次侵染，而且發(fā)病后傳播速度很快，對保護地番茄生產(chǎn)威脅極大。該病害已在全國各地普遍發(fā)生，且呈上升趨勢，已成為番茄設(shè)施栽培的主要危害因素[2]。目前，防治番茄灰霉病以化學(xué)農(nóng)藥為主，如代森錳鋅、嘧霉胺、異菌脲、腐霉利等。這些藥劑長時間、大劑量地使用，對環(huán)境和食品安全產(chǎn)生了大量負面影響，同時還產(chǎn)生了嚴重的抗藥性[3-4]。微生物的代謝產(chǎn)物是一個巨大的天然產(chǎn)物資源庫，從中篩選新農(nóng)用活性物質(zhì)是一條相對便捷的道路[5]。而且微生物源農(nóng)藥相對于化學(xué)農(nóng)藥具有低成本、高活性、低毒、環(huán)保等特點，因此以微生物天然產(chǎn)物為基礎(chǔ)，開發(fā)新型微生物源農(nóng)藥，可有效解決番茄灰霉病的危害。因此，本課題組深入挖掘了新疆高寒地區(qū)的放線菌資源，從中發(fā)現(xiàn)了具有較好抑菌活性的放線菌KN37。本研究主要對放線菌KN37菌株代謝物的抑菌譜進行了廣泛測定，同時利用離體法和活體法系統(tǒng)研究了菌株代謝物對番茄灰霉病的防治效果，旨在為KN37菌株的進一步研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試放線菌放線菌KN37，分離自新疆喀納斯地區(qū)，保存于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系農(nóng)藥實驗室。

1.2 供試病原菌番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄細菌性斑點病菌(Pseudomonassyringae)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)、黃瓜黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、稻瘟病菌(Phyriculariagrisea)、小麥赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、立枯病菌(Alterariaalternata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、白菜黑斑病菌(Alternariasolani)、玉米小斑病菌(Helminthosporiummaydis)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)均由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保系病理實驗室提供。

1.3 供試培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基：KNO31 g，K2HPO40.5 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，可溶性淀粉20 g，瓊脂20 g，蒸溜水1 000 mL，pH 7.2～7.4。PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸饋水1 000 mL。

1.4 發(fā)酵液的制備用打孔器取直徑4 mm的菌餅6個，置于配好的高氏一號液體培養(yǎng)基中掁蕩培養(yǎng)。搖床培養(yǎng)溫度為28 ℃，轉(zhuǎn)速為120 r·min-1，培養(yǎng)7～10 d。發(fā)酵液經(jīng)6 000 r·min-1離心30 min后，取上清待用。

1.5 發(fā)酵液提取物的制備噴霧干燥器對菌株發(fā)酵液進行濃縮，對干粉進行復(fù)溶和過濾后用大孔吸附樹脂AB-8進行分離，用25%乙醇/水進行洗脫，將洗脫液濃縮后用乙酸乙酯進行液液萃取，然后將乙酸乙酯相濃縮后得到菌株發(fā)酵液的提取物。

1.6 抑菌活性測定方法(1)菌絲生長速率法：將PDA培養(yǎng)基與發(fā)酵液或提取物按9∶1混合均勻，制成培養(yǎng)基平板，分別從供試病原菌的菌落邊緣，用打孔器切成直徑為4 mm的菌餅，分別放置于培養(yǎng)基中央，使菌餅帶菌絲的一面貼在培養(yǎng)基表面，空白對照不加放線菌KN37發(fā)酵液，每個處理重復(fù)3次。置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72～96 h后，用“十”字交叉法測量供試病原真菌菌落生長直徑，計算菌絲生長抑制率[6]。菌絲生長抑制率=(對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑)/(對照菌落生長直徑-菌柄直徑)×100%。(2)孢子萌發(fā)法：取供試病原菌孢子配成106CFU·mL-1懸浮液，在低倍鏡下的每個視野里有30～40個孢子，將發(fā)酵液或提取物與供試菌株的孢子懸浮液1∶1混合，每處理重復(fù)3次，在28 ℃下培養(yǎng)12 h后觀察計算孢子萌發(fā)率以及抑制率[7]。孢子萌發(fā)率/%=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100%；孢子萌發(fā)抑制率/%=(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/對照孢子萌發(fā)率×100%。(3)活體組織法：采摘大小均一、健康新鮮的番茄果實。表面用0.1% NaClO溶液消毒晾干后，接種番茄灰霉病菌菌餅；保護作用測定方法為將發(fā)酵液提取物(400 mg·L-1)噴施于番茄果實表面，22 ℃保濕培養(yǎng)24 h后接種番茄灰霉病菌菌餅；治療作用測定方法：在保濕條件下接種番茄灰霉病菌菌餅，24 h后再噴施供試藥液。藥劑對照為腐霉利400 mg·L-1，2個菌絲塊/果實試驗重復(fù)3次，5 d后調(diào)查病斑大小，計算藥效[8]。藥效/% =(對照病斑直徑-處理病斑直徑)/對照病斑直徑×100%。(4)田間試驗：于石河子大學(xué)試驗站溫室大棚種植番茄，試驗共設(shè)3個處理，處理1：空白對照；處理2：施用腐霉利(400 mg·L-1)；處理3：施用發(fā)酵液提取物(400 mg·L-1。每個處理3次重復(fù)，隨機區(qū)組排列，小區(qū)面積20 m2，株數(shù)36株每小區(qū)第一次施藥前調(diào)查病情基數(shù)，每隔7 d施藥1次，共施藥3次，施藥后7 d調(diào)查發(fā)病情況，5點取樣，每點調(diào)查3株番茄全株葉片，統(tǒng)計發(fā)病情況并計算病情指數(shù)和防治效果[9]。病情分級標準如下：

0級——無病斑；

1級——病斑占整個葉面積5%以下；

3級——病斑占整個葉面積5%～15%；

5級——病斑占整個葉面積16%～25%；

7級——病斑占整個葉面積26%～50%；

9級——病斑占整個葉面積51%以上。

根據(jù)調(diào)查結(jié)果計算病情指數(shù)和防效。病情指數(shù)=∑(各級病葉數(shù)×相對應(yīng)極值)/調(diào)查總?cè)~數(shù)×9；防治效果=(1-空白對照區(qū)施藥前病情指數(shù)×藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)/空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)×藥劑處理區(qū)施藥前病情指數(shù))×100%。

1.7 放線菌KN37菌株的初步鑒定(1)菌絲形態(tài)觀察：采用插片法接種菌株，用移液搶吸取50 μL孢子懸浮液于高氏一號培養(yǎng)基上，用涂布器將其涂布均勻，將蓋玻片斜插入培養(yǎng)基中，28 ℃條件下5 d后，待菌絲覆蓋于蓋玻片與培養(yǎng)基交叉處時，取下插片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察其觀察菌株的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲顏色和孢子及孢子絲形態(tài)。參考阮繼生等人的方法對待測菌株進行形態(tài)觀察和顯微結(jié)構(gòu)鑒定[10]。(2)菌落形態(tài)觀察：將少量的抱子絲接種于高氏一號培養(yǎng)基上，使其形成單菌落，28 ℃條件下5 d后，觀察菌落的形狀、顏色、質(zhì)地，以及平板正、反面的特征等一系列的形態(tài)特點。(3)分子鑒定：利用EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit(全式金，中國)進行放線菌基因組DNA提取，參考王秀爽等人的方法使用通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACG GCTACCTTGTTACGACTT-3′)對16S rDNA進行擴增[11]，PCR產(chǎn)物測序后進行Blast，選擇同源性較高的菌株用MEGA7.0軟件進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 放線菌KN37代謝物的抑菌譜放線菌KN37發(fā)酵液對多種植物病原菌具有較強的抑制作用(表1)，尤其是對番茄灰霉病菌、細菌性斑點病菌、番茄早疫病菌和油菜菌核病菌的抑制效果最好，抑制率分別為94.26%，93.66%，92.07%和95.67%。

表1 放線菌KN37發(fā)酵液對12種病原菌的菌落生長抑制作用Tab.1 Inhibition effect of actinomycete strain KN37 broth on 12 species of pathogens

注：抑制率為平均值±標準差(n=4)
Note：Inhibition rate is mean values ± SE(n=4)

2.2 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病菌的抑制作用為了進一步明確KN37菌株代謝物的抑菌效果，采用菌絲生長速率法對KN37發(fā)酵液及其乙酸乙酯提取物的毒力進行測定，結(jié)果顯示KN37發(fā)酵液的EC50為134.035 9 mg·L-1，乙酸乙酯提取物對番茄灰霉病菌的EC50為37.864 3 mg·L-1，均高于對照藥劑腐霉利的EC50值。

表2 放線菌KN37發(fā)酵液及提取物對番茄灰霉病菌菌絲生長的毒力Tab.2 The virulences of actinomycete strain KN37 broth and its extracts on mycelial growth of Botryptis cinerea

此外，放線菌KN37發(fā)酵液及其提取物也能顯著抑制番茄灰霉病菌孢子的萌發(fā)，其中發(fā)酵液處理孢子12 h后的EC50為40.300 5 mg·L-1(y= 3.233 3 + 1.100 5x，r= 0.982 0)，發(fā)酵液提取物的EC50為6.713 4 mg·L-1(y= 3.860 1 + 1.378 4x，r= 0.991 7)。KN37代謝物對孢子萌發(fā)的毒力顯著高于對菌絲生長的毒力，說明番茄灰霉病菌的孢子對KN37代謝物更為敏感。

2.3 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病的防治效果組織法測定結(jié)果表明，KN37發(fā)酵液提取物(400 mg·L-1)對番茄灰霉病具有較強的防治效果(圖1A)，其中保護作用(96.72%)與對照藥劑腐霉利(400 mg·L-1)效果相當，而治療作用(77.58%)顯著優(yōu)于對照藥劑。從圖1B可以看出，KN37發(fā)酵液提取物施于番茄果實表面后，病原菌無法深入侵染；即使病原菌已經(jīng)侵染，KN37發(fā)酵液提取物也能在一定程度上限制其進一步擴展，從而防止果實大面積腐爛的情況發(fā)生。

圖1 放線菌KN37代謝物對番茄灰霉病的保護與治療作用

利用KN37發(fā)酵液提取物(400 mg·L-1)防治溫室大棚內(nèi)的番茄灰霉病，結(jié)果表明，在施用3次發(fā)酵液后番茄灰霉病的發(fā)生率明顯降低，對番茄灰霉病的防治效果可達63.12%，與對照藥劑腐霉利效果(400 mg·L-1)相當(圖2A)，且番茄植株更加粗壯，葉片更綠(圖2B)。推測KN37代謝物中不僅含有抑菌物質(zhì)，還可能含有一些可以促進植物生長或誘導(dǎo)植物抗性的物質(zhì)。

圖2 放線菌KN37代謝物對溫室大棚番茄灰霉病的防治效果

圖3 放線菌KN37菌落(A)及孢子絲形態(tài)(B)Fig.3 Colony (A) and sporotrichial (B) of actinomycete strain KN37

2.4 放線菌KN37初步鑒定放線菌KN37在高氏1號固體培養(yǎng)基上生長狀況良好，菌落呈乳白色，圓形，質(zhì)地致密，表面干燥，內(nèi)源有凹陷中間有突起皺褶，菌落周圍呈輻射狀(圖3A)。氣生菌絲顏色為乳白色，發(fā)育良好，可生成多個長橢圓形孢子，孢子絲呈螺旋狀生長(圖3B)?；鶅?nèi)菌絲為白色，無色素分泌。通過利用16S rDNA進行BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)KN37菌株與Streptomyceskanamyceticus(NR 043822)的16S rDNA序列相似度達到96%，最為近緣(圖4)。結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果和分子鑒定結(jié)果，可將放線菌KN37歸屬為白色鏈霉菌類群。

圖4 基于16S rDNA序列分析的放線菌KN37系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討 論

新疆喀納斯地區(qū)生態(tài)環(huán)境特殊，具有豐富的微生物資源。從當?shù)胤蛛x得到的放線菌數(shù)量較多，其中不乏一些具有較好生物活性的菌株。韓立榮等人曾從喀納斯地區(qū)土壤中分離得到1株新放線菌StreptomyceskanasensisZX01，該菌可產(chǎn)生一種抗植物病毒的糖蛋白GP-1，同時，還可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，極具開發(fā)價值[12-13]。本課題組針對新疆高寒地區(qū)放線菌資源進行深度挖掘，目前已對天池和喀納斯地區(qū)放線菌進行了研究，從中發(fā)現(xiàn)具有農(nóng)用活性的放線菌數(shù)量占分離得到放線菌總數(shù)的7.32%，相比青藏高原地區(qū)(5.73%)較高[14]。由此可見，新疆高寒地區(qū)放線菌資源極為豐富，有待進一步開發(fā)利用。

放線菌KN37發(fā)酵液的抑菌譜測定結(jié)果表明，其對多種植物病害均具有較好的抑制效果，如番茄灰霉病、番茄早疫病、番茄細菌性斑點病等。此外，毒力測定表明，發(fā)酵液提取物對番茄灰霉病菌的毒力較強，對菌絲生長的EC50為37.859 6 mg·L-1，對孢子萌發(fā)的EC50為6.713 4 mg·L-1。以上結(jié)果表明，KN37菌株代謝物具有高效、廣譜的殺菌特點，可進一步分離純化得到抑菌化合物后開展農(nóng)藥制劑開發(fā)研究。

分子鑒定結(jié)果表明，S.kanamyceticus和KN37菌株的近緣菌(16S rDNA序列相似度為96%)，該菌為卡那霉素的產(chǎn)生菌。卡那霉素廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧及分子生物學(xué)方面，主要抑制細菌的蛋白質(zhì)生物合成[15]?？敲顾乇旧聿豢梢种普婢L，但有研究發(fā)現(xiàn)卡那霉素經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后可抑制真菌生長[16]。通過文獻調(diào)研，未發(fā)現(xiàn)S.kanamyceticus代謝物具有抗真菌活性.因此,結(jié)合16S rDNA分析結(jié)果可推斷KN37菌株與S.kanamyceticus并非同一種菌，下一步可結(jié)合代謝物分析及多項分類法對KN37菌株進行鑒定。