非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染過程中的作用

歐云文 劉俐君 代軍飛 馬炳 張永光 張杰

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046；2. 開江縣動物疫病預(yù)防控制中心，達(dá)州 636250；3. 達(dá)州市動物疫病預(yù)防控制中心，達(dá)州 635099）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、出血性豬傳染病，急性感染死亡率為100%［1]。急性和亞急性ASF常在多種器官上表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管性病變，如腎臟出血、淋巴結(jié)彌漫性出血、肺水腫、彌散性血管內(nèi)凝血和血小板減少等。其主要臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、有出血點、嘔吐和便血等［2]。因此，ASF被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的法定動物疫病之一，我國將其列為一類動物疫?。?]。1921年，在非洲（肯尼亞）首次發(fā)現(xiàn)ASF。1957年，歐洲（葡萄牙）首次暴發(fā)ASF疫情，隨后蔓延到全球多個國家和地區(qū)，如俄羅斯、烏克蘭、愛沙尼亞、拉脫維亞、波蘭等東歐國家和高加索地區(qū)［3-8]。2018年以來，全球有波蘭、俄羅斯、拉脫維亞、捷克、羅馬尼亞、摩爾多瓦、烏克蘭、匈牙利、保加利亞、比利時、科特迪瓦、南非、贊比亞和中國等14個國家發(fā)生ASF疫情，國際疫情形勢十分嚴(yán)峻［9]。2018年8月，遼寧省出現(xiàn)我國首例ASF疫情［10]。截至目前，在全國23個?。ㄊ?、自治區(qū)）先后發(fā)生100起疫情，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

ASFV是一種有囊膜的雙鏈DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是唯一蟲媒DNA病毒［11]。家豬、野豬和軟蜱均為ASFV的宿主，豬單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞為ASFV主要的靶細(xì)胞［12-13]。病毒基因組全長約為170-193 kb，基因組中間是一段長度約為125 kb的保守區(qū)［14-15]?；蚪M擁有150-167個開放閱讀框（ORFs），編碼150-200種蛋白質(zhì)，其中約50種為結(jié)構(gòu)蛋白［16]，主要結(jié)構(gòu)蛋白有pp220、pp62、p72、p54、p22和CD2v蛋白等。ASFV粒子由病毒類核、內(nèi)核芯殼、內(nèi)囊膜、衣殼和外囊膜中由內(nèi)向外組裝而成［16]。結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒粒子的主要成分，在ASFV吸附、侵入和復(fù)制等感染過程中起作用［16-17]。因此，本文綜述了ASFV結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用，以期為ASFV結(jié)構(gòu)蛋白的進(jìn)一步研究提供參考。

1 內(nèi)核芯殼蛋白

1.1 pp220和pp62蛋白

ASFV粒子直徑為170-190 nm，是由病毒類核、內(nèi)核芯殼、內(nèi)囊膜、衣殼和外囊膜組成復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，核心結(jié)構(gòu)直徑為70-100 nm，包括病毒基因組、編碼酶和被組裝成病毒顆粒的蛋白質(zhì)［16]。pp220和pp62蛋白為ASFV多聚蛋白前體，分別由CP2475L和CP530R基因編碼，屬于病毒感染過程中的晚期蛋白質(zhì)。pp220蛋白含有多個蛋白酶水解靶基序，在Gly-Gly-X（任意）氨基酸序列水解位點，病毒編碼的SUMO樣S273R蛋白酶將pp220水解為成熟的病毒粒子蛋白p150、p37、p14和p34。因此，成熟的病毒粒子中不含pp220蛋白。按照相似的機(jī)理，pp62被水解為p35和p15蛋白［17]，S273R蛋白酶作為ASFV編碼蛋白，也是病毒粒子內(nèi)核芯殼蛋白之一［18-19]。多聚蛋白水解產(chǎn)物主要位于病毒粒子內(nèi)核芯殼，約占病毒蛋白總量的30%，是內(nèi)核芯殼的主要成分，pp220、pp62的水解與病毒粒子的組裝是同時進(jìn)行，該類蛋白的水解產(chǎn)物在病毒衣殼的組裝過程中起關(guān)鍵作用［20-21]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，病毒顆粒主要聚集在靠近細(xì)胞核的離散細(xì)胞質(zhì)區(qū)域，該區(qū)域又被稱為“病毒加工廠”，pp220蛋白則位于“病毒加工廠”之中［22]。有學(xué)者進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，多聚蛋白pp220和pp62的加工需要病毒衣殼蛋白p72的表達(dá)，當(dāng)p72表達(dá)受阻時，未加工的多聚蛋白pp220和pp62組裝成異常的拉鏈樣結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由細(xì)長的膜結(jié)合蛋白組成。此外，pp220和pp62在COS細(xì)胞中共表達(dá)時，該兩種蛋白相互作用形成拉鏈樣結(jié)構(gòu)，pp220的表達(dá)則為pp62的加工奠定了基礎(chǔ)［19]。因此，pp220和pp62水解為p150、p37、p14、p34、p35和p15蛋白成為病毒顆粒成熟的重要標(biāo)志［23-24]，當(dāng)pp220和pp62蛋白的水解受阻，組裝的病毒顆粒則缺少內(nèi)核芯殼，或者組裝的病毒粒子不具有感染性［21-22]。

1.2 pp220和pp62蛋白水解產(chǎn)物

p37蛋白作為病毒內(nèi)核芯殼的組分之一，是ASFV編碼的第一個細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)骨架穿梭蛋白，具有輸出和輸入活性［25]。p37是pp220的水解產(chǎn)物，并與SUMO-1家族的蛋白酶具有較高的氨基酸序列相似性。通過對ASFV感染的細(xì)胞中p37進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)在病毒感染的早期，p37存在于細(xì)胞核的多個不同區(qū)域；而在感染后期，其僅存在于細(xì)胞質(zhì)［26]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，p37蛋白N-末端和C-末端區(qū)域主動從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，CRM1依賴性和CRM1非依賴性核轉(zhuǎn)運(yùn)途徑介導(dǎo)p37核酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，p37蛋白中疏水性氨基酸對上述3種核轉(zhuǎn)運(yùn)信號功能至關(guān)重要［27]。這些研究表明，p37核酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑對整個ASFV復(fù)制周期起著重要作用［26]。

p34蛋白作為重要的結(jié)構(gòu)蛋白，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，p34蛋白受胰蛋白酶的保護(hù)。同時，可從胞質(zhì)溶膠和膜組分中回收被錯誤加工的p34蛋白［21]。p34和p150蛋白膜相關(guān)組分可組裝成病毒基質(zhì)結(jié)構(gòu)，大多數(shù)被錯誤加工的p150亦可從胞質(zhì)溶膠之中回收，而p150的正確加工產(chǎn)物則被選擇性地聚集到內(nèi)囊膜［23]。p35和p15蛋白主要存在于內(nèi)核芯殼，其基質(zhì)樣結(jié)構(gòu)域位于含有DNA的類核和內(nèi)囊膜之間，p35、p15蛋白和pp220水解產(chǎn)物在病毒粒子中以等分子量形式存在［18]。p14蛋白作為pp220的又一水解產(chǎn)物，參與抑制病毒DNA的復(fù)制，屬于早期病毒蛋白。采用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)，該蛋白存在于被ASFV感染細(xì)胞的胞質(zhì)膜，p14特異性抗體介導(dǎo)ASFV感染細(xì)胞的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞溶解和抗體依賴性細(xì)胞毒性［28]。

有學(xué)者采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)對pp220和pp62蛋白成熟產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)兩種從未檢測到的小蛋白p8和p5［16]。p8蛋白是含有67個氨基酸序列的成熟蛋白，該蛋白由病毒pS273R蛋白酶在pp62蛋白Gly-Gly-X（任意）序列處切割水解而成。在第158-159氨基酸位點（GGG位點），pp62蛋白被水解切割為p15蛋白和中間前體（pp46蛋白）；在第463-464氨基酸位點（GGR位點），進(jìn)一步水解切割為成熟的p35和p8蛋白。p35和p15蛋白易被其特異性抗體檢測，但是通過免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)，pp46中間前體蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的p8抗體不能檢測p8蛋白，其原理尚不清楚［16，29-30]。p5蛋白為含有43個氨基酸序列的成熟蛋白，在pp220蛋白第44-45氨基酸位點（GGG位點）水解切割而成。p5蛋白與p8蛋白相比，其蛋白小，免疫原性低，可快速降解，不易被檢測［16，29-30]。有學(xué)者采用質(zhì)譜（MS）分析技術(shù)進(jìn)一步證實了p5和p8蛋白是病毒顆粒的結(jié)構(gòu)組分［16]?？傊琾p220、pp62及其水解加工產(chǎn)物在病毒的組裝和感染過程中具有重要的功能。

2 內(nèi)囊膜蛋白

2.1 p54蛋白

ASFV通過受體介導(dǎo)的胞吞機(jī)制進(jìn)入靶細(xì)胞，利用囊膜和內(nèi)吞泡膜的融合機(jī)制將病毒釋放到細(xì)胞漿。p54蛋白由E183L基因編碼，含有跨膜結(jié)構(gòu)域和Gly-Gly-X氨基酸基序，以及多種ASFV結(jié)構(gòu)蛋白的加工識別序列，位于病毒顆粒的內(nèi)囊膜，是ASFV非常重要的抗原蛋白［31]。有學(xué)者制備了一種具有感染性的重組ASFV，確定感染細(xì)胞內(nèi)病毒的運(yùn)動軌跡和速度，從而將“病毒加工廠”的形成動態(tài)實現(xiàn)可視化［31]。采用轉(zhuǎn)染細(xì)胞瞬時表達(dá)p54蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白主要存在于轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。當(dāng)p54蛋白合成受阻，則病毒粒子的形成受抑制。這表明，在病毒蛋白經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜時，p54蛋白扮演重要角色［32]。在ASFV感染的早期階段，p54可以激活caspase 3，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這是首次報道ASFV蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［33]。

在病毒感染期間，p54直接結(jié)合到動力蛋白C-末端的輕鏈8（LC8），進(jìn)而與微管動力蛋白相互作用［34]。采用核磁共振（NMR）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，p54和突觸后支架蛋白是動力蛋白輕鏈（DYNLL1）的兩個靶標(biāo)，這兩種蛋白與DYNLL1直接相互作用，同時谷氨酰胺對其結(jié)合起著重要作用，并且這些蛋白序列都含有GIQVD和KXTQT基序［35-36]。采用減毒毒株免疫接種動物，發(fā)現(xiàn)p54在誘導(dǎo)特異性抗體中起重要作用，p54抗體可以抑制ASFV的吸附［31，44]。因此，在桿狀病毒和大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)的p54常被用于ASFV的血清學(xué)診斷［37-38]。曹琛福等［39]采用單克隆抗體對p54蛋白抗原表位進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點。p54和p30蛋白作為與ASFV侵入宿主細(xì)胞密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，其在病毒感染過程中具有相似的作用。與此同時，p54和p30作為抗原蛋白，可聯(lián)合用于ASFV酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法的研發(fā)，提高檢測方法的靈敏度［38-40]。

2.2 pE248R蛋白及其他內(nèi)囊膜蛋白

pE248R蛋白是由E248R基因編碼的ASFV晚期結(jié)構(gòu)蛋白，是重要的內(nèi)囊膜蛋白，參與蛋白分子中二硫鍵的形成。在病毒感染過程中，該蛋白被?；幚?，并與病毒粒子內(nèi)囊膜相連［41]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，pE248R蛋白的缺失不影響病毒的吸附和內(nèi)化，但抑制病毒粒子在宿主細(xì)胞中復(fù)制，以及病毒基因的早期和晚期表達(dá)。因此，pE248R蛋白缺陷的誘導(dǎo)型重組ASFV內(nèi)囊膜與內(nèi)體膜不發(fā)生融合作用，抑制其向細(xì)胞質(zhì)核心區(qū)域轉(zhuǎn)運(yùn)［42]。pE248R和pE199L蛋白與痘病毒侵入/融合復(fù)合體具有很高的序列相似性，這表明該蛋白與ASFV融合機(jī)制有著密切聯(lián)系［42-43]。采用免疫電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，pE248R、p17、p12和pH108R蛋白位于病毒內(nèi)囊膜前體和“病毒加工廠”內(nèi)二十面體顆粒，而非細(xì)胞表面。p17和pE183L蛋白是病毒粒子組裝必需蛋白，而pE248R、p12和pE199L蛋白則與病毒侵入密切相關(guān)［20，41，44-45]。總之，在 ASFV 侵入宿主細(xì)胞后，pE248R蛋白對病毒基因的表達(dá)起重要作用。

p17蛋白作為ASFV重要的內(nèi)囊膜蛋白，是病毒內(nèi)囊膜上的跨膜蛋白，該蛋白可促進(jìn)病毒膜前體進(jìn)一步組裝為二十面體中間體，以及增強(qiáng)病毒活力。當(dāng)p17表達(dá)受阻，將抑制pp220和pp62蛋白的水解［45]。p12蛋白作為又一內(nèi)囊膜蛋白，由O61R基因編碼，參與病毒吸附，但是其吸附作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究［46]。p22蛋白由KP177L基因編碼，位于病毒顆粒外部，可被非離子去污劑從病毒顆粒表面上溶解處理。有學(xué)者采用冷凍切片免疫金標(biāo)記技術(shù)，確定p22蛋白的亞病毒定位［47]。J5R蛋白，又名pH108R蛋白，由H108R基因編碼，111個氨基酸組成，屬于ASFV感染晚期表達(dá)蛋白［44]。該蛋白N-末端含有跨膜結(jié)構(gòu)域，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)，在病毒復(fù)制和形態(tài)發(fā)生等方面起重要作用［48]。

表1 ASFV結(jié)構(gòu)蛋白的作用

3 衣殼蛋白

3.1 p72蛋白

p72蛋白由B646L（VP72）基因編碼，是ASFV主要衣殼蛋白，是病毒二十面體衣殼的主要成分，具有高度抗原性和免疫原性。在病毒感染的晚期階段，p72與其他相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及形成病毒衣殼都緊密相關(guān)［16]。在病毒顆粒形成初期，p72在細(xì)胞質(zhì)中富集，并與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜凸出的表面上形成病毒顆粒衣殼，在凹進(jìn)的表面上形成內(nèi)核芯殼［16，49]。p72參與ASFV的吸附和侵入過程，該蛋白的表達(dá)常作為病毒復(fù)制的標(biāo)志［49-51]。p72抗體可阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合，但是其在抗體介導(dǎo)的免疫保護(hù)中不起決定性作用，這或許是目前尚無有效ASF疫苗的重要原因之一［40]。有學(xué)者采用針對p72和A151R基因的小干擾RNA（siRNA）技術(shù)來控制ASFV的體外復(fù)制，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向基因p72的siRNA可以降低病毒的復(fù)制，以及信使RNA（mRNA）水平［52]。將來自不同地區(qū)的ASFV毒株p72編碼基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，p72基因在不同分離株中具有高度的保守性［53]。這表明，p72蛋白有較穩(wěn)定的抗原性，為ASFV抗原研究提供了良好的靶蛋白［54-57]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)p72蛋白N端第11-18位、第26-48位、第73-82位、第136-150位、第159-174位、第181-189位、第191-210位、第247-276位、第279-295位、第313-323位和第382-392位氨基酸為p72蛋白的抗原位點［58]。

3.2 其他衣殼蛋白

p14.5蛋白，又稱pE120R蛋白，是病毒衣殼蛋白之一，是DNA結(jié)合蛋白，參與抑制病毒DNA復(fù)制，是病毒粒子從“病毒加工廠”轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)膜過程中的必需蛋白質(zhì)。該蛋白由E120R基因編碼，參與病毒粒子的胞內(nèi)運(yùn)輸，其在病毒內(nèi)核芯殼和衣殼的形成過程中起著重要作用［59]。有學(xué)者采用二維凝膠電泳（2DE）和MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在病毒感染期間，p14.5蛋白N-末端丙氨酸（Ala）殘基被乙?；幚?。與正常表達(dá)條件下比較，當(dāng)pE120R蛋白表達(dá)受阻時，胞內(nèi)病毒滴度未受影響，但胞外病毒滴度比對照組低100倍［59-60]。p49蛋白由B438L基因編碼，屬于ASFV感染晚期表達(dá)的病毒衣殼蛋白，是形成具有感染性病毒粒子的必需結(jié)構(gòu)蛋白，由438個氨基酸組成，存在于“病毒加工廠”［61]。該蛋白缺乏時，組裝的病毒粒子不呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，而呈異常的管狀結(jié)構(gòu)。在病毒感染期間，pB438L蛋白與膜結(jié)合，表現(xiàn)為完整的膜蛋白［61-62]。

4 外囊膜蛋白

CD2v蛋白，又稱pEP402R蛋白，是一種糖蛋白，類似于T淋巴細(xì)胞表面的黏附受體CD2，由信號肽、跨膜域以及147個氨基酸的胞質(zhì)尾組成。在ASFV感染期間，調(diào)節(jié)性反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（TGN）蛋白復(fù)合物AP-1作為CD2v蛋白的靶標(biāo)。CD2v蛋白主要在T細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)，采用共聚焦顯微技術(shù)發(fā)現(xiàn)，大部分表達(dá)的CD2v蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)“病毒加工廠”周圍區(qū)域，而非細(xì)胞表面［63]。在缺乏細(xì)胞外配體時，絕大多數(shù)的CD2v蛋白主要位于細(xì)胞核周膜腔區(qū)域［64]。在感染后期，紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象表明感染細(xì)胞中CD2v蛋白得到表達(dá)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中，CD2v蛋白可被切割成N-末端糖基化和C-末端非糖基化兩種形式。與此同時，在感染細(xì)胞中，這兩種切割形式可與CD2v完整蛋白同時存在［63]。CD2v蛋白參與細(xì)胞間黏附、毒力增強(qiáng)和免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)過程，對ASFV的組織趨向性、免疫逃避等一系列致病機(jī)理起著重要作用［65]。CD2v蛋白可破壞淋巴細(xì)胞功能，并且該蛋白的表達(dá)與ASFV在家豬之間的傳播有著密切聯(lián)系。有學(xué)者采用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，CD2v蛋白的細(xì)胞質(zhì)尾部可與細(xì)胞質(zhì)接頭蛋白SH3P7相互作用，而SH3P7蛋白質(zhì)參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)，如囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［64]。有學(xué)者提出，將CD2v蛋白的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域作為新的遺傳標(biāo)記，這一特性可用于分析來自不同區(qū)域的ASFV毒株，并追蹤病毒的傳播軌跡，最終建立基于蛋白質(zhì)細(xì)胞外部分的全球毒株血清學(xué)分類體系［66-67]，研究ASFV毒株在自然界中的多樣性，并為疫苗研發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)［66-68]。p12蛋白C-末端區(qū)域富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，參與病毒的吸附，在病毒感染的晚期，由O61R基因表達(dá)，有學(xué)者通過免疫電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，該蛋白位于病毒粒子層，細(xì)胞表面的膜蛋白是ASFV的受體。在機(jī)體外，p12蛋白可阻斷ASFV侵入宿主細(xì)胞，但p12蛋白抗體被動接種機(jī)體內(nèi)，其不能中和ASFV，進(jìn)而達(dá)到被動保護(hù)機(jī)體的作用［69]。

5 總結(jié)與展望

ASF作為一種急性、烈性、出血性的豬傳染性疫病，給疫情發(fā)生國家（地區(qū)）的養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國作為對外貿(mào)易強(qiáng)國和養(yǎng)豬業(yè)大國，一旦ASF在我國完全定殖，將會給我國的養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失，ASF防控形勢不容樂觀［70-71]。ASFV基因型較多，種類龐大，免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜多樣。ASFV編碼蛋白的數(shù)量眾多，其中結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒顆粒的主要組分，參與病毒的吸附、進(jìn)入和復(fù)制等感染階段。雖然相關(guān)蛋白的研究不斷得到深入，但仍有大量編碼蛋白的功能，以及與宿主細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚，這系列問題必將成為ASFV研究的熱點。國內(nèi)學(xué)者先后對ASFV的致病機(jī)理、分子流行病學(xué)、診斷方法、疫苗研究等方面進(jìn)行了綜述［72-75]，對ASFV的致病機(jī)制有了一定的認(rèn)識，但仍有不足之處。因此，本文通過對參與ASFV感染的結(jié)構(gòu)蛋白，以及這些蛋白和宿主細(xì)胞之間相互作用的機(jī)制進(jìn)行綜述，進(jìn)一步闡釋ASFV結(jié)構(gòu)蛋白在感染過程中的作用，為我國的ASF防控提供理論參考。