雄性不育中花粉壁的研究進展

張江江 常麗 趙立寧 李德芳

（中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所，長沙 410205）

花粉壁是成熟雄性配子體表面的一層致密物質(zhì)，主要起到保護花粉、抵御外界環(huán)境物質(zhì)入侵及在植物授粉過程中識別雌性配子體等作用。目前，在雄性不育研究中，已克隆了一些與花粉壁發(fā)育相關的基因，證實在雄配子形成過程中花粉壁起到重要作用［1]。通過形態(tài)學觀察雄性不育植株，多數(shù)涉及花粉壁的不正常發(fā)育。因此，雄性配子體發(fā)育過程中花粉壁的研究對不育機理的解析有重要的理論意義。

1 花粉壁發(fā)育的模式

花粉壁主要由花粉外壁和花粉內(nèi)壁構成，花粉外壁位于最外層，包括含油層或者花粉胞被等結(jié)構?；ǚ弁獗谟址譃橥獗谕鈱雍屯獗趦?nèi)層，外壁外層由網(wǎng)狀結(jié)構組成，其結(jié)構包括覆蓋層結(jié)構和柱狀結(jié)構?；ǚ蹆?nèi)壁由內(nèi)壁外層和內(nèi)壁內(nèi)層構成，內(nèi)壁內(nèi)層和小孢子質(zhì)膜緊密接觸（圖1-D）。

花粉壁是雄性配子體外層起到保護作用的結(jié)構物質(zhì)，雖然發(fā)育過程在不同物種中不盡相同，但有些發(fā)育模式非常相似。根據(jù)花粉發(fā)育過程將其分為12個時期，整個花粉壁的發(fā)育模式如圖1所示，在擬南芥的第7時期的早期小孢子呈現(xiàn)為三分體結(jié)構，到晚期形成四分體結(jié)構。這時質(zhì)膜開始出現(xiàn)波動，這種結(jié)構變化由最開始點狀結(jié)構轉(zhuǎn)變?yōu)椴ɡ诵谓Y(jié)構。質(zhì)膜在初生外壁中的頂點接觸到最外層的胼胝質(zhì)后，孢粉素在接觸頂點開始累積，形成柱狀結(jié)構物質(zhì)的前體，隨后胼胝質(zhì)開始降解，當胼胝質(zhì)完全降解時小孢子釋放，此時初生外壁開始降解，孢粉素繼續(xù)累積形成柱狀結(jié)構，空腔結(jié)構形成覆蓋層。當初生外壁完全降解后，質(zhì)膜又恢復到起初的狀態(tài)（圖1-C）。隨后由絨氈層降解釋放的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成脂肪類物質(zhì)，填充外壁外層中由柱狀結(jié)構和覆蓋層結(jié)構組成的網(wǎng)狀結(jié)構，即含油層（圖1-A和圖1-B）。到雙核花粉時期絨氈層完全降解，此時形成成熟的花粉壁（圖1-C）。

目前，在雄性不育研究中很多涉及花粉壁的發(fā)育；獲得與雄性不育相關的基因均引起花粉壁的非正常發(fā)育。因此，在雄性不育機理解析中，對花粉壁形成過程的研究有著十分重要的作用。

2 初生外壁的發(fā)育

在一些植物減數(shù)分裂后期，已經(jīng)觀察到初生外壁，初生外壁是花粉壁發(fā)育起始的信號物質(zhì)，說明減數(shù)分裂后期花粉壁已經(jīng)開始發(fā)育。通過化學染色分析，發(fā)現(xiàn)初生外壁由中性/酸性多糖、蛋白質(zhì)和纖維素組成［4]。當小孢子母細胞發(fā)育到第7期時，初生外壁積累到一定程度并在小孢子母細胞的膜上形成點狀的突起，電鏡下小孢子縱切面顯示小孢子母細胞膜上的初生外壁堆積，壓迫質(zhì)膜，使質(zhì)膜形成波浪狀突起，構成花粉壁沉積發(fā)育的基礎［2]。

初生外壁的缺失會導致花粉壁發(fā)育異常從而引起雄性不育，說明初生外壁對于花粉壁的形成是至關重要的。目前發(fā)現(xiàn)的與初生外壁形成有關的擬南芥突變體ms1、dex1、nef1、rpg1、npu、efd和arf17都能造成花粉壁缺失。調(diào)控初生外壁形成有關的基因包括NPU、RPG1、DEX1、EFD和NEF1等，這些基因主要調(diào)控花粉初生外壁的形成。EFD（Exine formation defect）與初生外壁的形成有關［5]，突變體efd初生外壁缺失，孢粉素無法沉積，通過關鍵基因的回補依然不能恢復育性［6]。Hu等［7]證明了EFD主要在初生外壁形成過程中表達，在efd突變體中初生外壁異常降解，花粉外壁缺陷。ARF17（Auxin Response Factor17）是一個生長素的相應因子，Yang等［8]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中其主要參與初生外壁的形成，突變體arf17中初生外壁缺失，導致花粉壁缺陷和花粉退化，在擬南芥中AFR17通過調(diào)控CalS5影響初生外壁的形成，CalS5是與胼胝質(zhì)合成的相關基因，說明胼胝質(zhì)和初生外壁的形成之間有直接關聯(lián)。

花粉發(fā)育過程中初生外壁未隨質(zhì)膜形成波浪形結(jié)構會導致孢粉素累積異常，影響花粉發(fā)育。NPU（No primexine and plasma membrane undulation） 編碼的膜蛋白具有二次跨膜的結(jié)構，在四分體時期的小孢子及絨氈層細胞中檢測到其高度表達，該基因參與小孢子質(zhì)膜波浪形的形成和初生外壁的沉積。Chang等［9]的研究結(jié)果顯示npu突變體初生外壁完全缺失，質(zhì)膜未出現(xiàn)波浪形，隨后發(fā)育過程都受到影響，引起花粉外壁發(fā)育異常，最終影響雄配子育性。NEF1（No exine formation 1）基因轉(zhuǎn)運初生外壁所需要的特殊糖類物質(zhì)［10]，在突變體nef1中初生外壁缺陷，質(zhì)膜沒有波浪形起伏同時孢粉素出現(xiàn)異常沉積。RPG1（Ruptured pollen grain-1）作為糖的轉(zhuǎn)運蛋白，與初生外壁的合成有關。相應突變體rpg1中初生外壁合成顯著減少，小孢子質(zhì)膜表面也沒有形成波浪形結(jié)構，導致孢粉素沉積異常，引起外壁模式缺陷和花粉降解［11]。RPG1和RPG2同屬于MtN3/saliva家族，RPG1參與了初生外壁的沉積，rpg2突變體中成熟花粉中花粉外壁的網(wǎng)狀結(jié)構雖有一些變形，但不影響育性，另外發(fā)現(xiàn)rpg1rpg2雙突變體表現(xiàn)出更嚴重的不育性，rpg1突變體可由RPG2恢復育性，表明RPG1和RPG2都參與了花粉外壁的形成，且育性調(diào)控方面存在功能重復［12]。DEX1（Defective in exine formation 1）同樣作為花粉外壁發(fā)育不可缺少的基因，dex1突變體花粉外壁發(fā)育異常，初生外壁沉積延緩，DEX1可能通過調(diào)節(jié)CalS5來參與小孢子的形成［13]。

3 花粉內(nèi)壁的發(fā)育

花粉內(nèi)壁的發(fā)育始于花粉外壁形成的后期，通常為小孢子釋放后即單核花粉粒時期。一般認為花粉內(nèi)壁是由纖維素、果膠和內(nèi)壁蛋白等成分組成［14]。

纖維素是花粉內(nèi)壁的組成成分，也是小孢子發(fā)育成熟的必需物質(zhì)［15]。纖維素缺失的花粉中內(nèi)壁形成一個厚度不均勻的結(jié)構，會導致花粉內(nèi)壁發(fā)育缺陷，引起花粉壁發(fā)育異常?；ǚ蹆?nèi)壁形成過程中纖維素微絲提供細胞壁沉積的骨架，纖維合酶復合體的催化核心由3個CESA亞基組成，即CESA1、CESA3和CESA6，這些亞基缺失都會引起花 粉 功 能 缺 陷［16]。AtUSP（Arabidopsis udp-sugar pyrophosphorylase）在擬南芥中主要是參與到花粉內(nèi)壁果膠纖維素的合成，果膠纖維素是一種合成核苷酸糖的底物酶，突變體usp-1的花粉內(nèi)壁缺失但是可以通過轉(zhuǎn)入AtUSP得到恢復［17]；atusp-1突變體中主要通過抑制MIO（Myo-inositol Oxidation）途徑來阻遏基質(zhì)多糖和纖維素的合成，從而導致花粉內(nèi)壁合成受阻［18]。通過對油菜花藥不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組的動態(tài)分析，在花藥發(fā)育的后期檢測到許多與糖類代謝有關的基因表達，這些基因主要參與花粉內(nèi)壁的形成和成熟花粉中的淀粉積累，包括GH（Glycoside hydrolase family） 家 族、CE（Carbohydrate esterase family）家族和 GT（Glycosyl transferase family）家族，它們主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)化酶和果膠聚合酶來實現(xiàn)對花粉內(nèi)壁合成的調(diào)控［19]。

阿拉伯半乳糖蛋白是花粉壁的組成成分之一，合成受阻會導致花粉內(nèi)壁發(fā)育異常。Yang等［20]在雄雌異株中發(fā)現(xiàn)與內(nèi)壁合成相關的FLA和USP的含量相比于雌雄同株顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)CWI2和ST2參與脂類合成、運輸以及內(nèi)壁的形成。通過抑制FLA3表達來調(diào)控花粉內(nèi)壁的發(fā)育，雖然花粉外壁正常但花粉內(nèi)壁發(fā)育缺陷，花藥由單核花粉期到雙核花粉期轉(zhuǎn)變時內(nèi)壁出現(xiàn)厚度不均勻的異?，F(xiàn)象，推測FLA3參與了阿拉伯半乳糖的合成表達，抑制其表達導致花粉內(nèi)壁的異常發(fā)育和小孢子的敗育［21]。通過RNAi技術沉默OsUAM3，發(fā)現(xiàn)植株有異常的外壁，并伴隨著阿拉伯聚糖水平的降低［22]，但基因的遺傳調(diào)控機制尚不清晰。

在花粉壁形成的研究中，還有一些其他的途徑參與了花粉內(nèi)壁的形成。2個擬南芥ABC轉(zhuǎn)運因子ABCG1和ABCG16在絨氈層中表達，對花粉壁的形成有著重要的作用，在突變體abcg1和abcg16中都表現(xiàn)出花粉內(nèi)壁的缺失；有趣的是ABCG1和ABCG16的缺失在花粉中同樣引起絨氈層功能的失常［23]。MGT基因家族中 成 員MGT5（Magnesium transporter 5）和MGT9（Magnesium transporter 9）在鎂離子的吸收方面起作用，突變體mgt5和mgt9中都出現(xiàn)花粉內(nèi)壁缺失而花粉外壁正常的現(xiàn)象，說明Mg離子不足雄配子不能正常發(fā)育［24]。cap1（Collapsed abnormal pollen1）突變體幾乎喪失了所有細胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)，包括花粉內(nèi)壁，暗示了CAP1在植物中對花藥的發(fā)育起到至關重要的作用［25-26]。

4 絨氈層的發(fā)育

絨氈層位于花藥室的最內(nèi)層，主要在小孢子發(fā)育過程中提供營養(yǎng)和相關激素。四分體后期催化釋放小孢子的胼胝質(zhì)酶是由絨氈層分泌。在小孢子釋放后，絨氈層為小孢子的發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)。相關研究也發(fā)現(xiàn)了絨氈層的PCD（Program cell death）過程失常導致花粉壁的結(jié)構受損［27]，在花藥發(fā)育第8期早期絨氈層是致密的，但到第8時期晚期絨氈層呈現(xiàn)液泡化，第9時期小孢子釋放后絨氈層就收縮致密同時顏色也加深。花藥發(fā)育到單核花粉期時絨氈層幾乎完全降解，隨后到雙核花粉期絨氈層完全降解，最終形成的花粉富含淀粉素，這些淀粉素來自絨氈層［28]。絨氈層的提前或者延后降解都會引起雄性不育［29-30]，究其原因是絨氈層非正常降解會導致花粉壁的發(fā)育受損，因此，絨氈層適時的降解對于花粉壁的發(fā)育至關重要。

絨氈層缺失或過量都會導致花粉壁發(fā)育受損，影響最終育性。Zhao等［31]鑒定了一個有過量小孢子的擬南芥突變體ems1（Excess microsporocytes），它缺少絨氈層和絨氈層外的中層結(jié)構；雖然減數(shù)分裂時期ems1發(fā)育正常，但小孢子母細胞沒有經(jīng)過細胞分裂，導致小孢子發(fā)生過程異常隨后出現(xiàn)雄性不育。通過對雄性不育突變體exs（Extra sporogenous cells）的結(jié)構觀察，發(fā)現(xiàn)exs產(chǎn)生了一個額外性母細胞，但exs缺少絨氈層和中層細胞結(jié)構，胚胎的發(fā)育延緩導致形成更小的胚胎［32]。

絨氈層非正常降解會造成花粉壁發(fā)育異常，從而引起雄性不育。EMS1編碼富含亮氨酸受體蛋白激酶（LRR-RPK），其表達與絨氈層的發(fā)育有關，表明EMS1控制花粉壁的發(fā)育。通過細胞學觀察表明EMS1對孢子體早期階段不是必需的，但對于花粉壁的發(fā)育卻是必需的。Huang等［33]證明了βCAs（β-carbonic anhydrases）作為EMS1直接的下游位點，與βCAs蛋白結(jié)合起作用，當βCA失去功能后會引起絨氈層分泌失常，導致花粉壁發(fā)育異常，進而雄性不育。TPD1（Tapetum determinant1）分泌的富含半胱氨酸蛋白的配體和EMS1的LRR受體激酶在第二個位點區(qū)域結(jié)合，導致絨氈層細胞功能缺失引起小孢子增殖異常不能形成正常的雄性配子體［34]。

盡管絨氈層在花粉管發(fā)育的過程中起到重要作用，但其功能機制至今尚不十分清晰，有待進一步解析。

5 胼胝質(zhì)和孢粉素

5.1 胼胝質(zhì)的發(fā)育

目前，前人對花粉壁發(fā)育模式中的胼胝質(zhì)已經(jīng)有了較深入的研究。胼胝質(zhì)是一種β-1，3-葡聚糖，廣泛存在于植物中?；ǚ郾诘陌l(fā)育過程中，胼胝質(zhì)包裹著小孢子，隨后在四分體時期，胼胝質(zhì)沉積于小孢子表面起到臨時保護小孢子、限制小孢子異常膨大的作用，同時為花粉外壁的發(fā)育提供一個結(jié)構支撐，胼胝質(zhì)在花粉發(fā)育過程要經(jīng)歷兩次降解：第一次在減數(shù)分裂后形成四分體胼胝質(zhì)沉積于四分體表面；第二次是胼胝質(zhì)在四分體后期降解解釋放小孢子。

胼胝質(zhì)在GSL（Glucan synthase-like）的作用下合成，胼胝質(zhì)的合成從UDP-葡萄糖開始，UDP-葡萄糖直接與胼胝質(zhì)合成酶（GSL）催化劑的亞基相結(jié)合［35]。過去50年來，胼胝質(zhì)在花粉發(fā)育過程中的作用逐漸被鑒定出來。胼胝質(zhì)壁是一種臨時的細胞結(jié)構，來自于初生外壁和質(zhì)膜之間降解的胼胝質(zhì)，胼胝質(zhì)壁維持了小孢子形態(tài)以及保護小孢子免于外界環(huán)境的影響［36]。

目前發(fā)現(xiàn)的12個GSL（AtGSL1-AtGSL12）與胼胝質(zhì)的合成有關，它們多數(shù)被克隆和驗證，GSL1和GSL5功能緊密相關，在花粉發(fā)育過程中調(diào)控胼胝質(zhì)的形成，GSL2（Cals5）調(diào)節(jié)四分體時期胼胝質(zhì)的沉積［37-38]，突變體gsl2缺失胼胝質(zhì)壁，因此不能形成有活性的花粉［36]。突變體cs9（Callose synthase9）攜帶cs9等位基因，其純合體致死，雜合體產(chǎn)生一半有缺陷的花粉，同時胼胝質(zhì)異常沉積，形成早熟花粉［39]。在突變體gsl8和gsl10中，小孢子減數(shù)分裂過程出現(xiàn)不對稱分裂，導致胼胝質(zhì)不規(guī)則沉積［35]。與敲除GSL6和GSL11相比，敲除GSL5的植株的胼胝質(zhì)沉積降低顯著［40-41]。GSL1和GSL5在四分體時期胼胝質(zhì)壁沉積和釋放小孢子過程中表達，在突變體gsl1和gsl5中，胼胝質(zhì)在四分體時期不沉積，未形成明顯的胼胝質(zhì)壁。gsl1gsl5雙突變體相對于單突變體表現(xiàn)更加嚴重的不育性［37]。白菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)12個GSL，除GSL9外，其余均在花藥發(fā)育中被檢測到，不育花藥中GSL2、GSL5和GSL8表達量很高［42]。

胼胝質(zhì)的提前或者延后凋亡都會使花粉壁發(fā)育失常，引起雄性不育。Huang等［43]通過比較2個不育突變體，發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)的降解出現(xiàn)延后，花粉發(fā)育受損，究其原因是CDKG1先和snRNP結(jié)合，再通過RSZ33蛋白剪切掉CalS5的第6個內(nèi)含子從而影響其表達。bnms3突變體中，絨氈層在四分體后期沒有轉(zhuǎn)變?yōu)榉置陬愋图措蓦召|(zhì)沒有降解，小孢子未能正常釋放，推測BnMs3調(diào)控絨氈層的分化和胼胝質(zhì)的降解，同時參與孢粉素的合成調(diào)控和轉(zhuǎn)運［44-45]。李可琪等［46]對甘藍型油菜溫敏不育性TE5A的研究中發(fā)現(xiàn)該不育系高溫不育、低溫可育，低溫下正常開花的植株轉(zhuǎn)到高溫條件下則轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥?，不育植株沒有形成四分體結(jié)構，包裹著四分體的胼胝質(zhì)降解延遲，導致小孢子不能正常釋放，花粉發(fā)育晚期胼胝質(zhì)才降解。

除了上述途徑外，還有一些其他途徑通過參與胼胝質(zhì)的調(diào)控來影響最終的花粉育性。在煙草中，胼胝質(zhì)的過量表達導致花粉外壁富集胼胝質(zhì)壁和胼胝質(zhì)塞，即花粉外壁畸形形成不育花粉［47-48]。

5.2 孢粉素物質(zhì)的發(fā)育

孢粉素是花粉外壁的主要成分，是一種由多羥基脂肪族化合物和酚類物質(zhì)組成的生物聚合物［4]。孢粉素在絨氈層中合成，通過烏氏體轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜表面并在初生外壁上和孢粉素受體結(jié)合，是一種難分解的物質(zhì)，結(jié)構穩(wěn)定，不溶于一般的酸堿、脂溶劑和無機鹽，這是花粉壁結(jié)構穩(wěn)定的原因之一，但這一特征使得對其化學分析造成了挑戰(zhàn)。雖然孢粉素普遍存在于花粉和小孢子中，但在不同物種中這些器官所含孢粉素的含量是不相同的。與孢粉素有關基因的突變，會在四分體釋放小孢子后立即出現(xiàn)花粉壁的缺陷，一般會削弱雄配子育性［57]。

脂肪酸代謝與孢粉素合成密切相關，但鮮有通過脂肪酸代謝調(diào)控花粉壁發(fā)育的報道［49-50]。成熟的外膜結(jié)構中能清晰觀測到孢粉素的累積。根據(jù)發(fā)育模式的分析，孢粉素對于雄性不育中花粉壁的形成有著某些關聯(lián)，例如初生外壁上孢粉素不能正常累積會造成花粉壁結(jié)構缺陷從而引起雄性不育。

目前鑒定到與孢粉素合成相關基因有PKSA、PKSB、TKPR2、CYB703B1和ACOS5等。三重突變體acbp4acbp5acbp6擁有不規(guī)則花粉壁結(jié)構和異常的含油層，其花粉外壁缺失導致花粉不育［51]。孢粉素受體的累積與初生外壁的沉積之間存在某些關聯(lián)，孢粉素累積缺陷會導致初生外壁變異，引起敗育。ACOS5（Acry-coa Synthetase5）參與調(diào)控長鏈脂肪酸的乙酰化，催化合成孢粉素單體，突變體acos5-2中小孢子發(fā)育不正常，四分體釋放小孢子后退化和敗育，初生外壁的沉積顯著減少，孢粉素隨機無規(guī)律的分布于小孢子表面［52-53]，與絨氈層有關的調(diào)控因子DYT和TDF1參與了ACOS5的表達［54]。水稻OsMS2和擬南芥MS2高度同源，MS2是擬南芥中花粉發(fā)育的關鍵基因，敲除該基因的植株其絨氈層延遲降解，花粉壁結(jié)構較薄，且花粉外壁表面光滑，缺乏孢粉素的累積［55]。絨氈層MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MS188、MYB103、MYB80都參與了孢粉素合成的調(diào)控［56]。PKSA（Polyketide synthesis A）和PKSB（Polyketide synthesis B）催化脂肪酰輔酶A酯和丙二酰輔酶A聚合催化產(chǎn)生孢粉素合成的前體物質(zhì)，隨后TKPR1（Tetraketide α-pyronereductase1）和TKPR2通過降低酮羰基的合成來調(diào)控孢粉素的合成［57]。CYP703A2和CYP704B1在孢粉素合成過程中主要是編碼一個脂肪酸合酶，催化飽和長鏈脂肪酸向相應單羥基脂肪酸的轉(zhuǎn)變［53，58]。

6 展望

在雄性不育的形成過程中絨氈層的提前、延遲凋亡或者形成空泡狀都會導致后期花粉壁發(fā)育受限，引起雄性不育。胼胝質(zhì)代謝研究表明，在小孢子周圍胼胝質(zhì)代謝下降會導致初生外壁缺陷，花粉外壁沉積也受影響，說明胼胝質(zhì)在花粉壁發(fā)育中起到關鍵的作用。初生外壁形成缺陷會引起小孢子質(zhì)膜未能形成波浪狀結(jié)構，引起孢粉素沉積異常，花粉外壁發(fā)育異常，導致小孢子降解；孢粉素累積缺陷會導致花粉外壁缺陷，這些都會引起雄性不育。此外，高溫脅迫通過影響花粉壁的發(fā)育來調(diào)控雄性配子體育性，為雄性不育研究開拓了新思路。

圖2 花粉壁發(fā)育的過程以及相關調(diào)控基因［59]

由于花粉壁結(jié)構和組成較為復雜，雖然通過電鏡了解到一些作物花粉壁發(fā)育的大致過程，也在不同作物中克隆到一些與花粉壁發(fā)育相關的基因［59]（圖2），但作為一個復雜的生物學過程，其遺傳調(diào)控機理還需要進一步的解析。在花粉壁形成過程中，絨氈層與花粉細胞之間存在著大量的物質(zhì)交換，但它們的物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程和調(diào)控機理并不十分清晰。雄性不育研究中關于花粉壁發(fā)育的相關信號通路報道也較少，花粉壁的發(fā)育是如何導致雄性不育還有待進一步的解析。