凍存密度對外周血單個核細胞凍存效果的影響

林科佳 劉赴平 馬冬磊 胡銳 魏宗科 譚毅

（1. 深圳市潤科生物科技有限公司，深圳 518000；2. 東莞市南城醫(yī)院，東莞 523000；3. 中國人民大學統(tǒng)計學院，北京 100872）

與細胞傳代保存相比，細胞低溫冷凍保存可有效避免因細胞傳代過程中導致的污染、遺傳變異、大量人力財力付出，也可以最大限度保證細胞在長途轉移過程中的存活率［1-2]。大部分細胞都可通過程序降溫，最終長時間保存于液氮或液氮氣相層中［3-4]。在細胞凍存降溫，保存及復蘇過程中，凍存劑的種類，降溫升溫速率及凍存細胞密度均是影響細胞凍存效果的因素［5-6]。目前細胞凍存密度對凍存效果影響相關文章及報道較少，CIK細胞是臨床腫瘤治療比較常見的細胞類型［7-8]，培養(yǎng)技術亦相當成熟，研究者通過檢測復蘇后PBMC的活率以及CIK擴增的擴增倍數、淋巴細胞亞群、體外殺傷效率，探討細胞凍存密度對PBMC的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 分別采集3名健康志愿者外周血100 mL，在2 h內對血液進行處理。所有血液標本收集均征得志愿者同意，并簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 無血清培養(yǎng)基（GT-T511）購自日本TaKaRa公司，IFN-γ購自上海普欣生物技術有限公司，IL-1α、IL-2購自PeproTech公司，OKT3購自R&D公司，淋巴細胞分離液購自Nycomed Pharma AS公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，FITC標記的CD3，PE標記的CD4，PerCP標記的CD8，APC標記的CD56購自美國BD公司，Calcein-AM購自美國Thermo fisher公司，PI購自美國Sigma公司，DMSO購自美國Origen公司，K562白血病細胞系為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 PBMC提取 采集3名志愿者外周血各100 mL，轉移至離心管后離心，離心結束后，用移液器吸取上層淡黃色血漿層，并轉移到2個新的50 mL離心管內并配平剩余的液體即為濃縮的血細胞，將裝有血漿的兩個離心管放入56℃水浴箱內進行補體滅活30 min后離心，離心完畢后，取上清備用，置于冰箱2-8℃保存。用生理鹽水稀釋濃縮的血細胞，并用Ficoll法離分單個核細胞，離盡管完畢后，取1 mL進行細胞計數及流式檢測。計數后，根據細胞密度用移液管從細胞懸液中吸出1.5×107個細胞，加入到另一個50 mL離心管中用作新鮮組PBMC細胞CIK培養(yǎng)，剩下的細胞用作凍存。用作新鮮CIK培養(yǎng)的細胞用10 mL無血清培養(yǎng)基重懸，取200 μL進行細胞計數，活率檢測。根據細胞密度用移液管吸取1×107的細胞加入到T75培養(yǎng)瓶中，待用。用作凍存的細胞用3 mL 4℃預冷的自體血漿重懸，取200 μL進行細胞計數，活率檢測，待用。

1.2.2 CIK細胞培養(yǎng) 在T75培養(yǎng)瓶中補加無血清培養(yǎng)基到10 mL，控制細胞密度為1.0×106/mL，加入1 mL自體滅活血漿，加入1 000 U/mL IFN-γ。培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)液中添加0.1 μg/mL OKT3、1.0 ng/mL IL-1α與1 000 IU/mL IL-2，混勻，置于 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；細胞培養(yǎng)每隔 2 d補液并計數，補液后細胞密度維持1.2×106/mL［9-10]。

1.2.3 PBMC凍存 將每名志愿者3 mL滅活補體血漿細胞懸液均分為3份，根據細胞密度，將細胞用凍存液配制成 2.0×107/mL，4.0×107/mL，6.0×107/mL三個密度［9，11-13]，凍存液最終配比為：自體血漿：DMSO=9∶1［14]，將3個密度的細胞吸入到1.8 mL凍存管中，每支凍存管中裝量為1 mL。每管貼上標簽，放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，隔夜轉入-196℃氣相罐中。

1.2.4 細胞復蘇及再培養(yǎng) 細胞凍存180 d后，對3個凍存細胞密度組細胞進行復蘇。取出的凍存細胞管迅速放入37℃水浴鍋中，水浴至凍存管中留有微小冰塊，再用0.9%氯化鈉注射液重懸洗滌細胞，用10 mL無血清培養(yǎng)基分別對3個密度的細胞進行重懸，記數后各取出1.0×107個細胞，用無血清培養(yǎng)基定容到10 mL，控制細胞密度為1.0×106/mL，分別吸入到3個T75培養(yǎng)瓶中；重復步驟1.4對復蘇后的3組細胞進行CIK培養(yǎng)及計數［15]。

1.2.5 實驗分組 根據細胞類型分為新鮮組（F組）和凍存組（A組、B組、C組）2大類，如圖1，其中新鮮組（F組）采用未凍存PBMC誘導培養(yǎng)CIK；凍存組采用凍存PBMC誘導培養(yǎng)CIK細胞，按凍存密度共分為 2.0×107/mL 組（A 組）、4.0×107/mL 組（B組）和6.0×107/mL組（C組），每組3個樣本，種瓶時控制細胞密度為1.0×106/mL，每瓶10 mL。

1.2.6 細胞表型檢測 收集三名志愿者新鮮PBMC（0 d），擴增7 d及14 d的細胞，調整細胞密度至1.0×105/mL，FITC-CD3標記T細胞亞群，FITC-CD3PE-CD4標記輔助T細胞亞群，FITCCD3PerCP-CD8標記細胞毒性T細胞亞群，FITCCD3APC-CD56標記NKT及NK細胞亞群。

1.2.7 腫瘤殺傷活性檢測 取對數期生長的K562細胞株作為靶細胞，用PBS調整細胞密度為1.0-2.0×106cell/mL，加入calcein-AM，使終濃度為0.1-0.2 μmol/L，37℃培養(yǎng)箱避光孵育 30 min。離心，收集細胞沉淀，用PBS洗滌細胞2次，最后無血清的1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度為4.0×105cell/mL，分別取500 μL鋪于24孔培養(yǎng)板中。取新鮮PBMC或凍存PBMC制備的CIK細胞（調整細胞密度為8.0×106cell/mL），分別加入到24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μL，效靶比為20∶1，設3個復孔，并設置2個空白對照，放置在37度培養(yǎng)箱中，共同培養(yǎng)16 h。收集細胞，用緩沖液洗滌細胞2次，并用100 μL緩沖液重懸，加入2 μL的PI染色15 min，流式上機檢測細胞殺傷效率。

1.2.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量數據采用x-±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PBMC凍存前后活率比較

分別將3個志愿者樣品3個凍存密度組PBMC（A 組 ：2.0×107/mL；B 組 ：4.0×107/mL；C 組 ：6.0×107/mL）迅速復蘇后緩慢加入生理鹽水中，并定容到20 mL，充分混勻后取樣計數和檢測活率與新鮮PBMC組（F組）對比。結果（表1）顯示，A組活率（95.6±0.4%）相對F組（96.0±0.3%）差異無統(tǒng)計學意義，而B組（94.7±0.2%）、C組（94.9±0.4%）相對F組有顯著差異（P＜0.05）。

表1 PBMC凍存前后活率（±s，n=3，%）

表1 PBMC凍存前后活率（±s，n=3，%）

組別 活率/%F組 96.0±0.3 A組 95.6±0.4 B組 94.7±0.2 C組 94.9±0.4

2.2 PBMC凍存前后誘導CIK細胞擴增倍數比較

由 表 2可 以 看 出，F、A、B、C 4組 細 胞進行CIK細胞誘導培養(yǎng)后，擴增倍數分別達到 156.4±18.2、160.2±28.4、126.1±19.8和110.4±11.3倍，B、C組擴增倍數和F組相比有顯著差異（P＜0.05），而A組與F組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 PBMC凍存前后誘導ECIK細胞擴增倍數比較（±s，n=3）

表2 PBMC凍存前后誘導ECIK細胞擴增倍數比較（±s，n=3）

F組 A組 B組 C組0 d 1.0 1.0 1.0 1.0 3 d 0.9±0.1 0.9±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 5 d 1.5±0.1 1.2±0.1 1.3±0.2 1.1±0.1 7 d 10.2±1.0 10.6±1.2 9.2±1.8 7.4±0.8 9 d 32.8±8.2 34.4±6.5 26.9±6.2 23.9±5.5 11 d 54.3±6.0 59.5±10.3 46.2±5.0 43.6±6.3 14 d 156.4±18.2 160.2±28.4 126.1±19.8 110.4±11.3

2.3 流式表型

2.3.1 PBMC凍存前后細胞表型變化 A、B、C組PBMC復蘇后，與F組相比，淋巴細胞表型沒有明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3 PBMC凍存前后淋巴細胞表型比較（±s，n=3，%）

表3 PBMC凍存前后淋巴細胞表型比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組CD3+ 67.7±5.8 67.4±7.0 66.0±5.2 65.8±4.4 CD3+CD4+ 31.5±7.3 31.3±7.0 30.3±5.7 28.0±3.9 CD3+CD8+ 33.7±0.6 34.7±0.6 34.2±0.6 34.6±1.1 CD3+CD56+ 4.7±1.8 4.7±2.6 4.1±2.3 4.6±2.1 CD3-CD56+ 15.6±3.8 14.9±2.2 13.7±2.3 14.7±2.1

2.3.2 凍存前后培養(yǎng)過程中細胞表型變化 CD3+，CD3+ CD8+，CD3+CD4+，CD3+CD56+，CD3-CD56+細胞比較，4組細胞培養(yǎng)14 d，A/B/C組與F組相比，CD3+，CD3+CD8+，CD3+CD4+，CD3+CD56+，CD3-CD56+的比例均無明顯差異，見表4-8。

CIK細胞體外殺傷作用比較。4組細胞培養(yǎng)14 d，A/B/C組與F組對比，對K562細胞體外殺傷無明顯差異，見表9，圖1。

表4 PBMC凍存前后CD3+細胞比較（±s，n=3，%）

表4 PBMC凍存前后CD3+細胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 67.7±5.8 67.4±7.0 66.0±5.2 60.9±4.4 7 d 95.4±2.0 96.2±2.0 96.4±1.2 97.4±2.0 14 d 96.3±2.1 96.9±1.5 96.7±1.3 98.8±2.7

表5 PBMC凍存前后CD3+CD8+細胞比較（±s，n=3，%）

表5 PBMC凍存前后CD3+CD8+細胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 33.7±0.6 34.1±1.4 33.6±0.5 32.1±3.5 7 d 69.6±10.5 69.5±9.9 68.9±11.3 70.3±9.4 14 d 72.9±6.3 74.3±8.3 72.1±8.3 71.1±6.8

表6 PBMC凍存前后CD3+CD4+細胞比較（±s，n=3，%）

表6 PBMC凍存前后CD3+CD4+細胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 31.5±7.7 31.3±7.0 30.3±5.7 28.0±3.9 7 d 38.5±9.3 36.0±9.9 40.7±2.4 38.2±6.6 14 d 29.3±4.9 32.1±4.1 33.2±3.3 29.8±4.8

表7 PBMC凍存前后CD3+CD56+細胞比較（±s，n=3，%）

表7 PBMC凍存前后CD3+CD56+細胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 4.7±1.8 4.7±2.6 4.1±2.3 4.6±2.1 7 d 7.7±0.7 7.4±0.8 7.8±0.5 7.2±0.4 14 d 13.9±3.2 12.3±0.5 13.4±2.6 12.9±2.8

表8 PBMC凍存前后CD3-CD56+細胞比較（±s，n=3，%）

表8 PBMC凍存前后CD3-CD56+細胞比較（±s，n=3，%）

F組 A組 B組 C組0 d 15.6±3.8 14.9±2.2 13.7±2.3 14.7±2.1 7 d 3.3±2.2 2.9±2.0 3.0±1.6 2.6±2.0 14 d 1.8±1.1 1.6±0.8 1.6±0.6 1.6±1.1

表9 CIK細胞殺傷作用比較（±s，n=3）

表9 CIK細胞殺傷作用比較（±s，n=3）

組別 殺傷率/%F組 48.5±5.7 A組 49.5±4.9 B組 47.8±4.9 C組 44.7±2.7

圖1 CIK細胞殺傷作用比較

3 討論

近年來，隨著細胞銀行及細胞庫廣泛開展，對細胞凍存技術的要求也越來越嚴格。細胞凍存的質量直接決定了細胞復蘇后的應用。目前尚未見凍存密度對PBMC功能影響的文獻報道，偶見細胞系或其他體細胞對凍存密度的敏感性文獻［16-18]。通過CIK方式培養(yǎng)PBMC，可在一定程度上驗證凍存對PBMC功能的影響［19]。本研究通過設置不同PBMC凍存密度，并通過凍存PBMC與新鮮PBMC CIK培養(yǎng)效果對比，來驗證凍存密度對PBMC功能的影響。3個樣品（Donor A、Donor B和Donor C）的3個不同凍存密度細胞復蘇后再進行CIK培養(yǎng)，其中2.0×107/mL凍存密度組與新鮮組相比，誘導CIK細胞擴增倍數比較無明顯差異，甚至高于未凍存細胞；而4.0×107/mL和6.0×107/mL兩個密度凍存的細胞復蘇后誘導ECIK細胞培養(yǎng)14 d，擴增倍數與未凍存細胞相比擴增倍數有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義。從活率來看，2.0×107/mL凍存密度組與新鮮組相比，活率無明顯差異，而4.0×107/mL和6.0×107/mL兩個密度凍存的細胞復蘇后活率與新鮮組相比活率有顯著差異，具有統(tǒng)計學意義，

3種不同密度凍存的細胞復蘇后流式表型檢測結果與新鮮PBMC相比，無明顯差異，且凍存細胞與新鮮PBMC對比，經過誘導CIK細胞培養(yǎng)后，流式表型也無明顯差別，說明凍存對PBMC的表型和功能沒有影響。另外，3份樣品凍存前后培養(yǎng)CIK細胞14 d后體外殺傷作用檢測結果也無明顯差異。

Kawai等［20]在1988年的研究中認為，凍存后的PBMC（凍存密度為2.0×107/mL，凍存時間12個月）與新鮮組相比，淋巴細胞亞群比例無明顯變化，但誘導為LAK細胞及NK細胞后，對k562、Raji等腫瘤細胞體外殺傷效率較低，可能與其凍存劑的種類影響有關。

過高的PBMC凍存密度會影響其凍存效果而間接影響細胞的復蘇應用，而過低的凍存密度因為增加凍存體積而大大提高凍存成本，這兩點都是大樣本量細胞庫或細胞銀行要考慮到的問題。本實驗通過CIK擴增方法證明了2.0×107/mL、4.0×107/mL、6.0×107/mL三個凍存密度對PBMC的影響，本實驗研究人員將在未來的實驗中擴大凍存密度驗證范圍以及用更多的PBMC應用（培養(yǎng)）方法從多角度證明實驗觀點。

4 結論

通過本實驗可以看出，3個凍存密度對PBMC的表型及進行CIK培養(yǎng)后對K562的體外殺傷效率無影響，但4.0×107和6.0×107兩個凍存密度對PBMC復活的活率及CIK培養(yǎng)的擴增率有顯著影響。

由此可見，采用2.0×107密度凍存的細胞凍存后培養(yǎng)效果較好，且與未凍存細胞相比無明顯差異，均能達到制備需求，而采用4.0×107和6.0×107密度凍存后細胞擴增倍數均與未凍存細胞有一定差異，因此，選擇2.0×107密度進行凍存效果較好。