熒光假單胞菌2P24中RstA蛋白的功能鑒定

李諦音 何永興 韓建庭 李坤 王志平 李妙慧

（1. 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科 甘肅省泌尿系疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730030；2. 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞活動(dòng)與逆境適應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州730000；3. 四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院，成都610041）

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，Pf）是一種革蘭氏陰性可動(dòng)桿菌，廣泛分布于土壤、水等自然環(huán)境中［1]；其最適生長溫度和最適生長pH分別為4-32℃和4-8，具有廣泛適應(yīng)性、營養(yǎng)多樣性和代謝復(fù)雜性的特點(diǎn)［2]。一方面，Pf是生防菌株的重要一員并參與生物降解與工業(yè)生物轉(zhuǎn)化［3]，其產(chǎn)生的豐富次級(jí)代謝產(chǎn)物，如2，4-二乙酰基間三苯酚、吩嗪和藤黃綠菌素等［4-5]，及多樣的代謝機(jī)制已被廣泛研究。另一方面，Pf對(duì)環(huán)境中多種有害化合物的響應(yīng)機(jī)制也備受關(guān)注，尤其是多樣的抗生素抗性基因，很可能成為基因水平轉(zhuǎn)移的儲(chǔ)庫［6-7]。

研究表明，Pf對(duì)多種抗生素的耐受性常由外排系統(tǒng)介導(dǎo)。外排泵是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，廣泛存在于許多微生物基因組中，它不僅參與正常物質(zhì)運(yùn)輸和代謝，還能轉(zhuǎn)運(yùn)抗生素、重金屬、有機(jī)溶劑、去污劑等毒性分子，調(diào)節(jié)微生物對(duì)不同環(huán)境的適應(yīng)能力［8]。EmhABC是熒光假單胞菌2P24中最主要的RND（Resistance nodulation division）家族外排泵，其基因缺失菌株對(duì)氨芐西林、卡那霉素、慶大霉素等多種毒物的耐受性大幅下降［9]，可見EmhABC能夠顯著影響細(xì)菌對(duì)外界有毒物質(zhì)的抵抗能力，但目前對(duì)EmhABC的調(diào)控機(jī)制并不清楚。本研究中，我們鑒定了熒光假單胞菌2P24中一個(gè)新的OmpR家族轉(zhuǎn)錄因子RstA，證實(shí)RstA能夠直接調(diào)控外排泵基因emhABC的表達(dá)并影響細(xì)菌多重耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 野生型熒光假單胞菌2P24菌株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)張立群教授惠贈(zèng)；大腸桿菌DH5α、Wm3064及BL31（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自美國Novagen；表達(dá)載體pET28b、敲除載體pK18mobsacB及報(bào)告基因載體pRG970由本實(shí)驗(yàn)室保存；本研究中所使用的引物見表1。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

1.1.2 試劑與儀器 細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，Taq MIX購自北京佳蘭生物科技有限公司，T4連接酶、限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI、定量PCR相關(guān)制品購自大連寶生物工程有限公司，氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、洛美沙星、氨芐霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、IPTG購自百靈威科技有限公司，美羅培南、BSA購自索來寶生物，o-nitrophenol、咪唑購自美國Sigma-Aldrich。DU530 UV/Vis 分光光度計(jì)購自美國Beckman Coulter，NanoDrop2000購自美國Thermo Fisher，凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 共適應(yīng)性分析 Cofitness Browser Database（http：//fit.genomics.lbl.gov/cgi-bin/myFrontPage.cgi）由美國加州大學(xué)伯克利分校研究組建立，通過構(gòu)建隨機(jī)轉(zhuǎn)座子插入突變體庫并聯(lián)合全基因組測(cè)序（Random Bar Code Transposon-site Sequencing，RBTnSeq），評(píng)估了32株來自不同種屬菌株突變體對(duì)多種生長環(huán)境的適應(yīng)度。每個(gè)菌株內(nèi)都涉及上千種基因缺失突變；生長條件設(shè)置包括94種碳源、45種氮源及34-55種抗生素或金屬離子。具體評(píng)估過程如下：將某菌種所有轉(zhuǎn)座子突變株的混合體在某一生長條件下培養(yǎng)4-8代后，采用DNA Barcode Sequencing技術(shù)對(duì)比所有突變體培養(yǎng)前后各自標(biāo)記基因的豐度，并以培養(yǎng)前后該基因突變體豐度比值的對(duì)數(shù)表征菌株適應(yīng)度（Strain fitness）；基因適應(yīng)度Gene fitness為不同菌株適應(yīng)度的加權(quán)平均值，并通過計(jì)算t值評(píng)估每個(gè)基因的菌株適應(yīng)度值的一致性（|t|＜4時(shí)無參考意義），即：

在Cofitness Database中，參數(shù)Fitness即指上文中的Gene fitness，F(xiàn)itness＜0表示某基因?qū)δ程囟ㄉL條件的適應(yīng)很重要，F(xiàn)itness＞ 0則表示某基因?qū)υ鲋秤泻?，突變體具有生長優(yōu)勢(shì)。一般當(dāng)Fitness＜-2或＞ 2時(shí)表示對(duì)生長影響明顯。而數(shù)據(jù)庫中的Cofitness值則指同一細(xì)菌中一對(duì)基因的所有適應(yīng)度值具有Pearson相關(guān)性，即具有相似的適應(yīng)度模式。通常，Cofitness值＞ 0.75，提示兩基因可能在相同的通路中發(fā)揮作用；Cofitness值＞ 0.6，且它們的直系同源物Cofitness值也＞0.6，即保守共適應(yīng)性（Conserved Cofitness），則亦證實(shí)緊密功能關(guān)系［10-11]。本研究中分別BLAST EmhA、EmhB、EmhC蛋白序列后分析其共適應(yīng)蛋白及共適應(yīng)條件。熒光假單胞菌2P24基因組數(shù)據(jù)取自NCBI，同源序列比對(duì)采用軟件MEGA7.0完成。

1.2.2rstA基因缺失菌株的構(gòu)建 本研究中采用兩步同源重組法構(gòu)建基因缺失菌株［9]，即以熒光假單胞菌2P24基因組為模板，分別用引物rstAkoUF/rstAkoU-R和rstAkoD-F/rstAkoD-R擴(kuò)增出rstA上下游同源臂，并利用重疊延伸PCR技術(shù)融合［12]，隨后采用同源重組的方法將該片段構(gòu)入pK18mobsacB質(zhì)粒。重組質(zhì)粒先轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Wm3064感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后經(jīng)接合轉(zhuǎn)入熒光假單胞菌2P24中，經(jīng)Kan、Amp各50 μg/mL 的雙抗 King’s B（KB）培 養(yǎng) 基［13]（ 蛋 白 胨 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，K2HPO41.97 g/L，丙三醇10 mL/L）28℃過夜培養(yǎng)后，篩選出載體rstA刪除序列與基因組序列發(fā)生第一次同源重組成功的菌株并采用引物RstA-F/RstA-R加以驗(yàn)證，隨后該菌株于無抗KB培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)8 h后利用10%蔗糖無抗KB平板篩選，獲得第二次同源重組成功的菌株，經(jīng)引物RstA-F/RstA-R驗(yàn)證得到rstA基因缺失菌株。

1.2.3 抗生素最小抑制濃度測(cè)定 將熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1∶100接種至新鮮KB無抗培養(yǎng)基，28℃過夜培養(yǎng)后測(cè)定OD600，以1 OD600≈ 109CFU/mL計(jì)數(shù)并稀釋。準(zhǔn)備無菌96孔板，采用2倍稀釋法準(zhǔn)備不同濃度的抗生素培養(yǎng)基，取100 μL分別加入96孔板第1至第12孔，之后于每孔中加入100 μL稀釋后菌液，確保每孔約104-105個(gè)細(xì)胞，每種抗生素設(shè)置三次平行試驗(yàn)，每板設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照組，即以雙蒸水代替抗生素，其余操作步驟均相同。將平板置于28℃搖床培養(yǎng)16-18 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的吸光值OD570，獲得抗生素對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）［14]。

1.2.4emhA及emhC轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株以1∶100接種至新鮮無抗KB培養(yǎng)基，于28℃搖至OD600= 0.3。按RNA提取試劑盒說明提取總RNA，確定RNA濃度及純度后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明獲得cDNA并于-20℃保存。設(shè)計(jì)靶基因emhA（引物AQ-F/ AQ-R）、emhC（引物CQ-F/CQ-R）及參照基因16S rRNA（引物16s-F/16s-R）的qRT-PCR引物，以cDNA為模板，采用Real Master Mix（SYBR Green）試劑盒完成qRT-PCR。最后以ΔΔCT法進(jìn)行目的基因表達(dá)量分析。

1.2.5 β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn) 在pRG970半乳糖苷酶表達(dá)基因上游融合emhABC基因的調(diào)控序列（引物emhAlacZr-F/emhAlacZr-R）［15]，將構(gòu)建的 pRG970-pemhABC報(bào)告質(zhì)粒經(jīng)供體菌（大腸桿菌WM3064感受態(tài)細(xì)胞）接合轉(zhuǎn)入熒光假單胞菌2P24野生型及ΔrstA菌株。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入成功的菌株以1∶100接種至新鮮無抗KB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至OD600= 0.6后檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性［16]。

1.2.6rstA基因的克隆 以熒光假單胞菌2P24基因組為模板，采用引物RstA-F/RstA-R擴(kuò)增出rstA全基因序列，將該擴(kuò)增產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28b分別使用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI進(jìn)行同步雙酶切，凝膠回收后T4連接酶連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑選雙酶切驗(yàn)證成功的重組表達(dá)載體pET28b-rstA送至金唯智測(cè)序。

1.2.7 RstA蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主BL21（DE3），并轉(zhuǎn)接于50 mL含Kan（50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)。過夜培養(yǎng)物按1∶50轉(zhuǎn)接到1 L含Kan（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，16℃誘導(dǎo)表達(dá)20 h后通過離心收集菌體（8000×g，10 min），而后用30 mL懸浮液（20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸菌體并超聲破碎，經(jīng)4℃，12 000×g，30 min離心得上清液并采用Ni-NTA親和柱純化目標(biāo)蛋白，掛載的His-RstA蛋白由洗脫液（20 mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L咪唑，400 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗脫后采用超濾法進(jìn)行溶液置換，使咪唑濃度低于5 mM，最終將蛋白濃度濃縮至4 mg/mL凍存于-80℃待用。

1.2.8 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 利用引物FAM-emhAp-F/FAM-emhAp-R擴(kuò)增emhA基因啟動(dòng)子區(qū)域，并用NanoDrop2000測(cè)定其濃度，將純化后的DNA片段（0.225 pmol/L）與不同濃度純化后的His-RstA蛋白在EMSA結(jié)合緩沖液中混合，反應(yīng)的體系為20 μL，于常溫下孵育30 min后加入5 μL上樣緩沖液，通過6%的非變性PAGE電泳檢測(cè)結(jié)合活性［17]。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子RstA與外排泵EmhABC共適應(yīng)性分析

采用Cofitness Browser Database 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)EmhABC的共適應(yīng)蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。分別對(duì)熒光假單胞菌外排泵EmhABC不同組件EmhA、EmhB、EmhC在該數(shù)據(jù)庫中BLAST后，選擇匹配度高且注釋顯示同為RND外排泵家族的Pf6N2E2_2823（98.1%identity）、Pf6N2E2_2824（98.9%）、Pf6N2E2_2825（99.4%）作為emhABC的功能同源蛋白［11]（表2），分別預(yù)測(cè)其共適應(yīng)蛋白后結(jié)果顯示：Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825三者之間互為最強(qiáng)共適應(yīng)關(guān)系，Cofitness值及Conserved值均大于0.9；同時(shí)，三者共適應(yīng)物列表中均可見Pf6N2E2_463（注釋為轉(zhuǎn)錄因子蛋白R(shí)stA），共適應(yīng)強(qiáng)度排名分別為9#、9#、11#（圖 1-A），Cofitness值分別為 0.5、0.53、0.53，且Conserved值均大于0.6。同時(shí)在Pf6N2E2_463共適應(yīng)物列表中Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825分 別 位 于 列 表 的 11#、7#、8#位，Cofitness值及Conserved值同上。對(duì)比Pf6N2E2_463 與 Pf6N2E2_2823、Pf6N2E2_2824、Pf6N2E2_2825在多種生長條件的適應(yīng)度（Fitness）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)它們的基因缺失突變株對(duì)多種有害物質(zhì)脅迫環(huán)境的適應(yīng)度下降，其中夫西地酸、四環(huán)素、洛美沙星、壯觀霉素及氯霉素等是它們有著共同適應(yīng)度改變的脅迫條件，F(xiàn)itness值均在-1 - -6之間（圖1-B）。

表2 EmhABC不同組件同源蛋白

2.2 熒光假單胞菌中rstA同源序列比對(duì)

以熒光假單胞菌2P24基因組為檢索對(duì)象，將Pf6N2E2_463基因序列BLAST后得到序列C0J56_12295，經(jīng)序列比對(duì)明確C0J56_12295（rstA）是Pf6N2E2_463在熒光假單胞菌2P24中的同源序列，序列匹配度（Identity）大于90%。rstA編碼序列全長702 bp，編碼多肽含有233個(gè)氨基酸。RstA蛋白預(yù)測(cè)分子量為26.30 kD，理論等電點(diǎn)為5.53。

2.3 rstA基因缺失菌株的鑒定

經(jīng)編碼框內(nèi)刪除的方式構(gòu)建rstA基因缺失菌株（ΔrstA），框內(nèi)刪除后剩余序列約250 bp。如圖2（左）示單交換菌落篩選結(jié)果，即相比野生型熒光假單胞菌2P24菌株，以引物RstA-F/RstA-R 擴(kuò)增后分別在700 bp和250 bp顯示條帶，說明pK18mobsacB載體上包含的rstA編碼框內(nèi)刪除后序列已同熒光假單胞菌2P24基因組發(fā)生第一次同源重組。隨后，經(jīng)10%蔗糖固體培養(yǎng)基篩選后得到發(fā)生第二次同源重組的菌株，如圖2（右）示雙交換菌落篩選結(jié)果，即由引物RstA-F/RstA-R擴(kuò)增得到兩種長度的單一片段，其中若第二次同源重組后回復(fù)為野生型菌株，則條帶位于700 bp；若位于250 bp附近，則表明rstA編碼框內(nèi)刪除后序列已在基因組水平完全取代原序列，ΔrstA菌株構(gòu)建成功。

2.4 RstA直接影響熒光假單胞菌多重耐藥性

抗生素最小抑制濃度（MIC）測(cè)定顯示，相較于熒光假單胞菌2P24野生型菌株，ΔrstA菌株對(duì)多種抗生素敏感性增加，其中氯霉素、卡那霉素及慶大霉素對(duì)ΔrstA的MIC值均降低4倍，強(qiáng)力霉素降低8倍；而氨芐霉素、四環(huán)素、洛美沙星和美羅培南對(duì)ΔrstA的MIC值下降不顯著，降低2倍或不變（表3）?？梢奟stA能夠直接影響熒光假單胞菌2P24對(duì)多種抗生素脅迫環(huán)境的耐受。

圖1 外排泵EmhABC與轉(zhuǎn)錄因子RstA的共適應(yīng)分析

圖2 rstA基因缺失菌株的構(gòu)建

表3 多種抗生素對(duì)三種菌株的MIC值（μg/mL）

2.5 RstA正向調(diào)節(jié)emhABC的表達(dá)

ΔrstA菌株中emhA與emhC基因的mRNA水平較野生型下降超過3倍（圖3）；同樣，β-半乳糖苷酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也顯示，ΔrstA菌株中β-半乳糖苷酶的活性較野生型下降3倍（圖4）。該結(jié)果表明RstA對(duì)emhABC有正向調(diào)控作用。

2.6 RstA蛋白的表達(dá)與純化

構(gòu)建pET28b-rstA重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，如圖5可見27 kD處有一明顯條帶，說明目標(biāo)蛋白His-RstA已成功表達(dá)。經(jīng)固定金屬離子親和色譜的方法對(duì)His標(biāo)簽蛋白純化后得到如圖所示高純度His-RstA蛋白。

圖3 qRT-PCR檢測(cè)emhA、emhC基因轉(zhuǎn)錄水平

圖4 β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)emhABC表達(dá)水平

圖5 His-RstA蛋白純化SDS-PAGE電泳圖

圖6 重組蛋白His-RstA與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合活性

2.7 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示：隨著RstA蛋白濃度的升高，emhABC基因上游調(diào)控區(qū)內(nèi)長度為0.225 pmol/L DNA片段的遷移速率逐漸降低，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)終濃度達(dá)到4 μmol/L時(shí)，反應(yīng)體系中大部分DNA的遷移被阻滯，表明RstA能夠特異性地結(jié)合在emhABC啟動(dòng)子區(qū)域。

3 討論

熒光假單胞菌2P24最早分離自山東省小麥根際周圍的土壤中［18]，目前大多研究主要針對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物2，4-二乙?；g三苯酚的產(chǎn)生與調(diào)節(jié)［16，19]、群體感應(yīng)效應(yīng)對(duì)其在植物根際定植的影響［20]、抗生素合成調(diào)節(jié)［21]及三型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能［22]等方面展開。EmhABC是目前報(bào)道熒光假單胞菌2P24中最重要的RND家族外排泵，張立群課題組研究發(fā)現(xiàn)，EmhABC不僅參與調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物2，4-二乙?；g三苯酚的產(chǎn)生，還顯著影響細(xì)菌對(duì)多種毒性小分子的耐受性［9]。為了進(jìn)一步明確熒光假單胞菌2P24對(duì)該重要外排泵的調(diào)控機(jī)制，我們借助Cofitness Browser數(shù)據(jù)庫及序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)OmpR家族轉(zhuǎn)錄因子RstA同EmhABC存在共適應(yīng)性，二者對(duì)多種抗生素脅迫環(huán)境的適應(yīng)貢獻(xiàn)相似。因此，我們推測(cè)RstA很可能同EmhABC位于同一調(diào)控通路。為了證實(shí)這一猜想，我們首先構(gòu)建了rstA基因缺失菌株，明確RstA直接影響熒光假單胞菌2P24對(duì)多種抗生素的耐藥性。之后，通過對(duì)emhA、emhC轉(zhuǎn)錄水平及emhABC表達(dá)水平的檢測(cè)，證實(shí)RstA能夠正向調(diào)控emhABC的表達(dá)，這也同共適應(yīng)性預(yù)測(cè)結(jié)果及抗生素敏感性測(cè)定實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。

OmpR家族成員均為DNA結(jié)合蛋白，屬于翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其蛋白折疊模式很保守，即包含有與DNA大溝相互作用的識(shí)別螺旋，及與DNA小溝接觸的側(cè)環(huán)或“側(cè)翼”，常結(jié)合于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［23]。OmpR家族成員幾乎均為雙組分系統(tǒng)中的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（Response regulator，RR）組分，常與同源的組氨酸激酶蛋白（Histidine kinase，HK）組分一起參與微生物對(duì)外界環(huán)境的感受和應(yīng)答［24]。RR常經(jīng)磷酸化后發(fā)生構(gòu)象改變而獲得功能活性，并進(jìn)一步發(fā)揮調(diào)控作用［25]。據(jù)報(bào)道，OmpR家族RR常通過發(fā)生二聚體化結(jié)合在DNA啟動(dòng)子區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列，進(jìn)而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制功能［26]。

根據(jù)NCBI中的功能預(yù)測(cè)注釋，RstA屬于RR，為了進(jìn)一步明確RstA對(duì)emhABC的調(diào)控機(jī)制，我們表達(dá)純化出RstA蛋白，并通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)證實(shí)RstA能夠特異性地結(jié)合在emhABC上游啟動(dòng)子區(qū)域，表明RstA能夠直接與emhABC啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生相互作用，但其中更為深入的作用機(jī)制，如二者的互作位點(diǎn)、RstA同源HK在其中扮演的角色及RstA的效應(yīng)模式是否符合OmpR家族RR的常規(guī)工作模式等仍需深入研究。當(dāng)然，RstA是否還參與調(diào)控其他生理功能也需要進(jìn)一步探索。觀察ΔrstA與ΔemhABC相較于野生型對(duì)各抗生素的敏感性變化不難發(fā)現(xiàn)，二者的抗性變化譜存在一定差異，因此我們推斷RstA很可能還通過調(diào)控其他外排泵影響細(xì)菌的多重耐藥性。

4 結(jié)論

本研究以熒光假單胞菌2P24為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的OmpR家族轉(zhuǎn)錄因子RstA并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定。結(jié)果表明，RstA通過結(jié)合在emhABC上游啟動(dòng)子區(qū)域正向調(diào)控emhABC的表達(dá)，并可能經(jīng)多個(gè)途徑影響熒光假單胞菌2P24的多重耐藥性。