大腸桿菌乙醇工程菌mglB基因的敲除對(duì)混合糖發(fā)酵木糖利用效率的影響

許瓊丹 王永澤 王金華 趙筱

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院 武漢 430068）

木質(zhì)纖維素材料降解產(chǎn)生的糖類可用于微生物發(fā)酵，但葡萄糖會(huì)對(duì)木質(zhì)纖維素材料中其他糖類的利用產(chǎn)生影響。木質(zhì)纖維素中約有四成左右的糖類如木糖和阿拉伯糖因?yàn)槠咸烟堑拇嬖诙鵁o法得到徹底的利用［1]。這主要是因?yàn)榉纸獯x產(chǎn)物阻遏效應(yīng)（Carbon catabolite repression，CCR），即葡萄糖的存在會(huì)抑制阻遏其他糖類（如木糖）的代謝，使得大腸桿菌只有優(yōu)先利用完葡萄糖后，才能再利用其他糖類［2-3]。該阻遏效應(yīng)與磷酸烯醇式丙酮酸-糖類磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS）密切相關(guān)。PTS系統(tǒng)負(fù)責(zé)特異性地將葡萄糖從細(xì)胞外跨膜主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解途徑［4]。在此轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，可溶性蛋白EIIAGlc（由crr基因編碼）和結(jié)合在質(zhì)膜上的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EIIBGlc（由ptsG基因編碼）的去磷酸化狀態(tài)的積累，與分解代謝產(chǎn)物阻遏直接相關(guān)［5-6]。遺傳分析也得到相同結(jié)論，突變crr基因和ptsG基因，可弱化分解代謝產(chǎn)物阻遏［7-8]。國(guó)內(nèi)外已有許多通過改變PTS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)量的方法來降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，從而提高木糖利用效率，增強(qiáng)發(fā)酵強(qiáng)度，提高發(fā)酵產(chǎn)量的研究報(bào)道。Nichols等敲除ptsG基因的乙醇工程菌可利用混合糖發(fā)酵，產(chǎn)率達(dá)理論值的 87%-94%［9]。Liang等［10]通過敲除pflB，ldhA，ppc和ptsG基因構(gòu)建的工程菌混合糖發(fā)酵產(chǎn)琥珀酸，產(chǎn)量達(dá)到83 g/L。丁小云等［11]敲除ptsG基因的乳酸工程菌可同時(shí)利用葡萄糖和木糖發(fā)酵產(chǎn)D-乳酸，產(chǎn)量為83.04 g/L。Yao等［12]發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)crp基因能夠使大腸桿菌同時(shí)消耗葡萄糖和木糖，而敲除ptsG，或mgsA，或pgi基因都可以導(dǎo)致crp基因轉(zhuǎn)錄水平的增加?？梢钥吹剑壳皩?duì)于混合糖利用都側(cè)重于降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)以提高木糖的利用。

葡萄糖的入胞除了依賴PTS系統(tǒng)進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)之外，也可依賴于半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)等非PTS系統(tǒng)來完成。目前已知半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有兩種運(yùn)輸載體半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GalP）和MglBAC復(fù)合蛋白（MglA：ATP結(jié)合蛋白；MglB：糖結(jié)合蛋白；MglC：跨膜運(yùn)輸?shù)鞍祝?，可?duì)葡萄糖進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)［11-12]。GalP是一種H+共轉(zhuǎn)移載體，在將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)的同時(shí)需要轉(zhuǎn)運(yùn)H+。MglBAC復(fù)合蛋白屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的ABC（ATP-binding cassette）家族，轉(zhuǎn)運(yùn)過程中需要額外消耗ATP［13-14]。不同于PTS系統(tǒng)的邊轉(zhuǎn)運(yùn)邊磷酸化，這兩種運(yùn)輸載體在轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖時(shí)不改變其構(gòu)象，之后由葡萄糖激酶（Glk）催化生產(chǎn)葡萄糖-6-磷酸進(jìn)入糖酵解途徑。這些同屬于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因?qū)δ咎堑睦檬欠裼杏绊?，目前還鮮有報(bào)道。

在前期的工作中，我們以產(chǎn)纖維乙醇的大腸桿菌工程菌SZ470為出發(fā)菌，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了ptsG缺陷菌株SZ470P，通過降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)增加混合糖發(fā)酵時(shí)木糖的利用效率［15]。本文中，我們擬敲除非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)且也能轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的基因，即半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的mglB基因，得到mglB缺失菌SZ470M和ptsG/mglB雙缺陷株SZ470PM。通過發(fā)酵驗(yàn)證和轉(zhuǎn)錄水平分析，明晰葡萄糖非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因?qū)δ咎抢眯实挠绊?，探?PTS和非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)是否對(duì)木糖利用存在協(xié)同影響，從而為木質(zhì)纖維素木糖充分利用提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 出發(fā)菌株分別為大腸桿菌乙醇工程菌SZ470和SZ470P。SZ470是能夠利用五碳糖發(fā)酵高產(chǎn)乙醇的工程菌，其來源于野生菌株Escherichia.coli B，并敲除了乙酸激酶（ackA），延胡索酸還原酶（frdABCD），丙酮酸甲酸裂解酶（focA-pflB），D-乳酸脫氫酶（ldhA）等基因，并通過無氧啟動(dòng)子融合表達(dá)技術(shù)倍增了NADH還原力［16-18]；SZ470P則是在SZ470的基礎(chǔ)上敲除了參與葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的編碼基因ptsG［15]。質(zhì)粒pKD4（包含F(xiàn)RT-kan-FRT閱讀框），同源重組質(zhì)粒pKD46（溫度敏感型復(fù)制子，Ampr）。出發(fā)菌株與質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 DNA Marker，PCR Master Mix購(gòu)自Fermentas公司，細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)于天根生物有限公司。氨芐青霉素和卡那霉素購(gòu)自Mersco公司，PCR引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。分析純葡萄糖、蔗糖及其他無機(jī)鹽等購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

Sartorius BB-8846880發(fā)酵罐（德國(guó)Sartorius Stedim Biotech公司），Waters e 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），GC-2014/SHIMAD20氣相色譜儀（美國(guó)GC公司），mycycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），MicroPluser電轉(zhuǎn)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉5 g/L；種子培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：LB 培養(yǎng)基加混合糖（3%葡萄糖和2%木糖）或單糖（5%木糖）；選擇培養(yǎng)基：LB 固體培養(yǎng)基加抗生素（50 mg/L 氨芐青霉素或卡那霉素）。

1.2 方法

1.2.1mglB基因的敲除 PCR引物設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 mglB的敲除引物與鑒定引物

根據(jù)mglB序列設(shè)計(jì)敲除引物P1和P2，如表1所示，該對(duì)引物5'端45 bp片段與mglB基因序列同源，另外18-20 bp（表中下劃線序列）與質(zhì)粒pKD4上FRT-kan-FRT閱讀框序列同源，以pKD4為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到帶有卡那霉素抗性基因的PCR片段。擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 5 min。用 CaCl2法將pKD46轉(zhuǎn)化入SZ470和SZ470P的細(xì)胞中，通過氨芐平板篩選得到陽性菌落。將陽性菌落的細(xì)胞在添加2%的L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中，30℃條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)至OD600= 0.6。經(jīng)過無菌去離子水清洗后，得到SZ470/pKD46，SZ470P/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞。再用電轉(zhuǎn)的方法將擴(kuò)增的PCR片段分別轉(zhuǎn)化到這兩種感受態(tài)細(xì)胞中。30℃復(fù)蘇培養(yǎng)2 h，涂布于含卡那霉素的LB 培養(yǎng)基選擇平板。37℃培養(yǎng)24 h，挑選生長(zhǎng)良好的陽性單克隆在卡那霉素抗性平板上轉(zhuǎn)接1-2次，并用鑒定引物P3、P4進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。將成功敲除mglB基因的SZ470和SZ470P 菌株分別命名為SZ470M和SZ470PM。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng) 挑4-6個(gè)在LB平板上生長(zhǎng)了24 h的單菌落，接入200 mL種子培養(yǎng)基，200 rpm，37℃培養(yǎng)至OD600為0.8-1.2左右。以10%的接種量將細(xì)胞接種至3 L發(fā)酵培養(yǎng)基，置于帶有自動(dòng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)7 L發(fā)酵罐，200 rpm，37℃培養(yǎng)發(fā)酵。定時(shí)取樣，測(cè)定菌體濃度OD600，糖濃度，乙醇及其他代謝產(chǎn)物的濃度等。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物檢測(cè)分析 菌體濃度測(cè)定在可見光分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)600 nm 下OD 值。葡萄糖、木糖采用高效液相色譜法分析，色譜柱為Bio-Rad HPX 87H，流動(dòng)相為4 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測(cè)器為PDA、ELS 檢測(cè)器。乙醇采用氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件：采用氫離子火焰檢測(cè)器（FID），毛細(xì)管柱，柱溫40℃，進(jìn)樣溫度200℃，檢測(cè)器溫度200℃，載氣為氮?dú)?，流? mL/min，正丙醇作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣0.5 μL。乙醇理論產(chǎn)量計(jì)算：1 mol 葡萄糖產(chǎn)生2 mol 乙醇，1 mol 木糖產(chǎn)生1 mol 乙醇。乙醇轉(zhuǎn)化率為實(shí)際產(chǎn)量與理論產(chǎn)量之比。

1.2.4 基因轉(zhuǎn)錄水平差異分析 收集混合糖發(fā)酵24 h的細(xì)胞，根據(jù)的方法提取總RNA，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并用QTaqTMOne-Step qRT-PCR S對(duì) YBR? KIT進(jìn)行目標(biāo)基因的定量分析。引物序列見表2。以cysG作為內(nèi)參基因［19]，以SZ470中目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄水平為對(duì)照，計(jì)算SZ470M，SZ470P和SZ470PM中各目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平的差異倍數(shù)。對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 mglB基因缺陷菌株SZ470M和SZ470PM的鑒定

分別以SZ470和SZ470P為對(duì)照，以鑒定引物P3和P4對(duì)菌株SZ470M和SZ470PM進(jìn)行PCR驗(yàn)證，其結(jié)果如圖1所示。根據(jù)RED同源重組技術(shù)的原理，擴(kuò)增的卡那霉素抗性基因PCR片段具有與mglB基因同源的45 bp序列，該片段通過同源重組整合到菌株基因組上從而將目的基因敲除。因此，SZ470M和SZ470PM經(jīng)鑒定引物PCR擴(kuò)增后其產(chǎn)物大小為1550 bp，與卡那霉素抗性基因PCR片段大小一致。而對(duì)照菌株SZ470和SZ470P的鑒定引物擴(kuò)增產(chǎn)物則為mglB基因，片段大小為999 bp。圖1中結(jié)果符合預(yù)期，說明mglB基因敲除成功。

2.2 混合糖發(fā)酵

2.2.1 菌體生長(zhǎng)曲線 在以水稻秸稈為代表的木質(zhì)纖維素水解液中，由纖維素以及半纖維素降解得到的葡萄糖約占60%，而由半纖維素降解得到的木糖以及少量阿拉伯糖等糖類占其他40%［20]。因此，本研究中設(shè)定3%葡萄糖+2%木糖的混合糖發(fā)酵條件，對(duì)比SZ470，SZ247M，SZ470P，SZ470PM的菌體生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖2所示。SZ470發(fā)酵24 h時(shí)，OD達(dá)到最大9.2從而進(jìn)入穩(wěn)定期；SZ470M和SZ470P在30 h時(shí)OD值分別達(dá)到9.8和10.6，SZ470PM則在42 h OD值為11.8。雖然SZ470最先進(jìn)入穩(wěn)定期，但其最大OD值為4株菌中最小，而SZ470M，SZ470P和SZ470PM的最大OD值分別為SZ470最大OD值的1.06，1.15和1.28倍。在發(fā)酵的前42 h內(nèi)，相對(duì)SZ470而言，SZ470M的菌體生長(zhǎng)量與其相差不大；而SZ470P和SZ470PM的菌體增長(zhǎng)則更為明顯，說明后兩者可以攝取更多的碳源，用于菌體生長(zhǎng)。

表2 qPCR擴(kuò)增引物

圖1 mglB基因敲除驗(yàn)證

圖2 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470混合糖發(fā)酵（3%葡萄糖+2%木糖）的菌體生長(zhǎng)情況

2.2.2 葡萄糖與木糖消耗曲線 四株菌的葡萄糖的消耗情況如圖3和表3所示。四株菌在24-48 h內(nèi)可發(fā)酵完葡萄糖。由于mglB基因的敲除，SZ470M和SZ470PM相對(duì)于各自的出發(fā)菌株而言，葡萄糖消耗速度都有所降低。說明mglB基因可以通過阻斷葡萄糖通過MglBAC復(fù)合蛋白運(yùn)輸途徑來降低葡萄糖入胞速度。而SZ470PM葡萄糖糖耗速度的進(jìn)一步降低，說明葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的阻斷對(duì)于葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)速度的下降有疊加效應(yīng)。對(duì)比SZ470PM和SZ470可知，mglB和ptsG的敲除使葡萄糖的消耗速度下降43%，消耗時(shí)長(zhǎng)則增加近一倍。

四株菌的木糖消耗情況與如圖4和表3所示。SZ470和SZ470M的發(fā)酵周期最長(zhǎng)，并且在前24-30 h時(shí)間內(nèi)，即葡萄糖消耗完畢之前，木糖基本沒有消耗，整個(gè)發(fā)酵周期木糖消耗速度沒有明顯變化。該結(jié)果說明單獨(dú)敲除mglB基因，并不能降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，對(duì)木糖的利用效率也沒有明顯影響。而SZ470P和SZ470PM木糖消耗與葡萄糖消耗可同時(shí)進(jìn)行，說明分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)在這兩株菌中程度有所降低。如表3所示，SZ470P和SZ470PM的木糖消耗速度分別為0.28 g/（L·h）和0.37 g/（L·h），相對(duì)于SZ470的木糖消耗速度分別提高了33%和76%。該結(jié)果說明ptsG基因的缺失，可以有效降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，使得木糖與葡萄糖同時(shí)利用。而雙缺陷菌SZ470PM的木糖消耗速度比ptsG缺陷菌SZ470P提高32%，說明在降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的基礎(chǔ)上，mglB基因的敲除也可提高木糖利用效率。

圖3 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470混合糖發(fā)酵（3%葡萄糖+2%木糖）的葡萄糖消耗曲線

表3 SZ470，SZ470M，SZ470P和SZ470PM混合糖發(fā)酵的比較

圖4 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470混合糖發(fā)酵（3%葡萄糖+2%木糖）的木糖消耗曲線

2.2.3 乙醇產(chǎn)量 四株菌的乙醇產(chǎn)量如圖5和表3所示，在發(fā)酵的前24 h，SZ470的乙醇產(chǎn)量高于其他3株菌。發(fā)酵30 h之后，SZ470PM和SZ470P的乙醇產(chǎn)量超過SZ470。SZ470和SZ470M發(fā)酵90 h，乙醇產(chǎn)量分別是18.98 g/L和19.25 g/L。SZ470P 的乙醇產(chǎn)量為21.16 g/L，相較于SZ470，產(chǎn)量提高了2.18 g/L，轉(zhuǎn)化率提高9.3%。SZ470PM的乙醇產(chǎn)量為23.25 g/L，相較于SZ470，產(chǎn)量提高了4.27 g/L，轉(zhuǎn)化率提高15.1%；相較于SZ470P，產(chǎn)量提高了2.09 g/L，轉(zhuǎn)化率提高了5.8%。

圖5 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470M，SZ470P，SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470混合糖發(fā)酵（3%葡萄糖+2%木糖）的乙醇產(chǎn)量

2.2.4 木糖代謝關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平分析 從發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，ptsG基因的敲除和ptsG/mglB基因的雙敲除，都可提高混合糖發(fā)酵時(shí)木糖的消耗速度，乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度及產(chǎn)量。為了進(jìn)一步探討葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因的缺失對(duì)混合糖發(fā)酵時(shí)木糖利用效率的影響，將混合糖發(fā)酵24 h的細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過Real-time qPCR對(duì)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析，結(jié)果如圖6所示。以SZ470為對(duì)照，SZ470M只有xylG基因有明顯差異，其他目標(biāo)基因差異不顯著，說明木糖代謝相關(guān)途徑?jīng)]有明顯改變，這與SZ470M在混合糖發(fā)酵時(shí)其發(fā)酵能力與SZ470相差不大的結(jié)果相符。而SZ470P和SZ470PM中xylA，xylB，xylE，xylF和xylH的基因轉(zhuǎn)錄水平有顯著性提高，且后者程度更強(qiáng)。說明ptsG基因的敲除和ptsG/mglB基因的雙敲除，可提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝途徑關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高混合糖發(fā)酵時(shí)木糖代謝效率，進(jìn)而提高乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度。

圖6 混合糖發(fā)酵（3%葡萄糖+2%木糖）時(shí)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝基因轉(zhuǎn)錄水平的變化（發(fā)酵24 h）

2.3 SZ470與SZ470PM木糖發(fā)酵

SZ470PM與SZ470混合糖發(fā)酵結(jié)果對(duì)比說明ptsG/mglB基因的雙敲除對(duì)木糖的利用效率有明顯提高。為探討木糖作為單一碳源發(fā)酵時(shí)這兩個(gè)基因?qū)δ咎抢眯实挠绊?，?%木糖為碳源對(duì)SZ470PM和SZ470進(jìn)行發(fā)酵，其糖耗曲線和乙醇產(chǎn)量如圖7所示。結(jié)果表明，SZ470和SZ470PM在96 h內(nèi)將木糖完全消耗，最終乙醇產(chǎn)量分別為21.56 g/L和21.87 g/L，且兩者的木糖消耗速度和乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度沒有明顯差別。而從兩株菌的菌體生長(zhǎng)情況來看，也無明顯差別（如圖8）。

圖7 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470木糖（5%）發(fā)酵的糖消耗曲線和乙醇產(chǎn)量

圖8 大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因缺陷菌SZ470PM與出發(fā)菌株SZ470木糖（5%）發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)情況

3 討論

綜合四株菌的混合糖發(fā)酵情況來看，mglB基因和ptsG基因的敲除都可以降低葡萄糖的消耗速度，原因是分別阻斷葡萄糖通過MglBAC和PTS兩種轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的運(yùn)輸，造成葡萄糖入胞通量減少。從菌體生長(zhǎng)情況來看，SZ470P和SZ470PM的菌體增長(zhǎng)則更為明顯，說明后兩者可以攝取更多的碳源，用于菌體生長(zhǎng)。而SZ470PM的菌體生長(zhǎng)量高于SZ470P，原因可能為通過阻斷能量消耗較高的MglBAC運(yùn)輸途徑，使得葡萄糖入胞的能量消耗降低，使更多的能量用于菌體生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵乙醇總產(chǎn)量增加。從木糖利用效率來看，單獨(dú)敲除mglB基因并不能提高木糖消耗速度。只有敲除ptsG基因才可通過降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)，達(dá)到葡萄糖與木糖同時(shí)利用從而提高木糖消耗速度，說明葡萄糖非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)不能單獨(dú)對(duì)木糖利用效率產(chǎn)生影響。而ptsG/mglB雙缺陷菌SZ470PM木糖消耗速度高于SZ470P，說明在敲除ptsG基因降低分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)的基礎(chǔ)上，mglB基因的敲除對(duì)木糖利用效率的提高具有協(xié)同效果。因此，SZ470PM在四株菌中木糖消耗速度相對(duì)于SZ470，SZ470M，SZ470P分別提高了76%，76%和32%。綜合來看，SZ470PM體現(xiàn)出在混合糖發(fā)酵條件下木糖利用效率高，發(fā)酵周期短，乙醇產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)。

從混合糖發(fā)酵條件下木糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平的分析上看，也可得到相同結(jié)論。木糖通過H+共運(yùn)輸載體XylE和專一性運(yùn)輸載體XylFGH轉(zhuǎn)運(yùn)入胞，編碼這兩種載體的基因xylE和xylFGH受蛋白XylR的調(diào)控［21]。木糖入胞后由XylA催化形成木酮糖，再由XylB催化形成木酮糖-5-磷酸。以SZ470為對(duì)照，SZ470P和SZ470PM與木糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平都有顯著上調(diào)，且SZ470PM的上調(diào)程度要高于SZ470P。說明通過敲除ptsG基因，可以通過阻斷與分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)相偶聯(lián)的PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來降低對(duì)木糖代謝途徑的抑制，從而提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平；而進(jìn)一步敲除mglB基因，則對(duì)木糖木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)有協(xié)同影響。和SZ470P相比，SZ470PM木糖H+共運(yùn)輸載體的編碼基因xylE的上調(diào)趨勢(shì)要比專一性運(yùn)輸載體XylFGH的編碼基因xylF，xylG，xylH的上調(diào)趨勢(shì)更加明顯，原因是專一性運(yùn)輸載體XylFGH比木糖H+共運(yùn)輸載體XylE更耗能［22-23]，所以從能量的角度來考慮木糖入胞更趨向于通過木糖H+共運(yùn)輸載體XylE來轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，xylE基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)更為顯著。

但由菌株SZ470PM與SZ470在木糖單糖發(fā)酵情況比對(duì)來看，ptsG與mglB雙基因的敲除，并沒有對(duì)木糖利用效率造成顯著影響。其原因可能在于，以木糖為單一碳源時(shí)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)代謝相關(guān)基因無需大量編碼相關(guān)蛋白，細(xì)胞也不需要消耗能量用于葡萄糖分子的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝。因此，SZ470PM與SZ470的菌體生長(zhǎng)，木糖消耗速度以及乙醇產(chǎn)量無明顯差異。說明，葡萄糖PTS和非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因只有在混合糖條件下對(duì)木糖利用才存在協(xié)同效應(yīng)。

綜上，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因ptsG和mglB基因的敲除，可降低混合糖發(fā)酵時(shí)分解代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)和葡萄糖入胞速率，提高木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而提高木糖消耗速度及利用效率。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)大腸桿菌葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因mglB的敲除，構(gòu)建的ptsG/mglB雙缺陷乙醇工程菌SZ470PM，在混合糖發(fā)酵時(shí)，具有木糖利用效率高，發(fā)酵周期短，乙醇轉(zhuǎn)化率高的特點(diǎn)，是具有可利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇的潛力。通過比較混合糖發(fā)酵性能和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平分析，得出葡萄糖PTS和非PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)基因?qū)δ咎抢么嬖趨f(xié)同影響，為木質(zhì)纖維素木糖的高效利用提供一定理論依據(jù)。