小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因的克隆及原核表達分析

王海波 郭俊云 田雪蓮

（1. 曲靖師范學院 云南高原生物資源保護與利用研究中心 云南省高校云貴高原動植物遺傳多樣性及生態(tài)適應性進化重點實驗室，曲靖655011；2. 曲靖師范學院 生物資源與食品工程學院，曲靖 655011）

能源植物小桐子是目前世界上最主要的生物柴油植物之一，我國在“十五”、“十一五”、“十二五”能源發(fā)展綱要中都把發(fā)展小桐子產(chǎn)業(yè)列為可再生能源中長期發(fā)展規(guī)劃的重點［1]。小桐子（Jatropha curcasL.）屬大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹屬（Jatropha）多年生落葉半肉質(zhì)小喬木或大灌木［2]。原產(chǎn)中南美洲地區(qū)，目前在我國滇、黔、川、桂、閩、粵及瓊等省份有較多野生資源分布［3]。其種子含油量高，且流動性與石化油摻和性好，在閃點、凝固點、含硫量等關鍵技術指標上達到了歐四標準，成為未來最有可能替代化石能源的潛力樹種，具有廣闊的開發(fā)與利用前景。

蔗糖非發(fā)酵-1型相關蛋白激酶家族（Sucrose non-fermenting-1 related protein kinase，SnRK）屬絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）類蛋白激酶超家族（Protein kinase Superfamily），通過共價修飾調(diào)節(jié)（Covalent modification）廣泛參與植物細胞分裂、物質(zhì)代謝、基因表達調(diào)控及生物與非生物抗逆響應等過程［4]。根據(jù)蛋白質(zhì)序列聚類結果將SnRK家族分為SnRK1、SnRK2、SnRK3三個亞家族［5]。其中，SnRK1與酵母SNF1（Sucose non-fermenting 1）和哺乳動物AMPK（AMP-activated protein kinase）在結構與功能上同源性較高，共同組成SNF1蛋白激酶家族［6]，負責感知并響應胞內(nèi)低糖/低能量狀態(tài)（Energysensing protein kinase family）。根據(jù)氨基酸序列的相似性與表達模式，SnRK1可進一步分為SnRK1a與SnRK1b兩類［7]，其中，SnRK1a在所有植物中均有表達，而SnRK1b僅存在于單子葉植物中，且具有種子高表達特異性［5]。在植物中，SnRK1存在于信號轉(zhuǎn)導的中間部位，本身受到上游因子磷酸化調(diào)節(jié)，又可以通過磷酸化調(diào)節(jié)下游諸多關鍵蛋白，如α-淀粉酶（α-amylase，α-AMS）［8]、磷酸蔗糖合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）［5]、6-磷酸海藻糖合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）［9]、3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase，HMGR）［10]、硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）［11]、天冬酰胺合成酶（Asparagine synthetase1，ASN1/DIN6）、脯氨酸脫氫酶（Proline dehydrogenase，ProDH）［12]等，從而廣泛參與糖代謝及糖信號應答反應（響應高蔗糖/低葡萄糖信號）［13]、蔗糖合成、淀粉合成與降解［14]、生長發(fā)育［5]及逆境應答［15-16]等生理生化過程。

SnRK1蛋白激酶是由α、β、γ三個亞基組成的異源三聚體，其中催化亞基α具有保守的激酶結構域及核心序列。第一個被克隆的SnRK1 α亞基基因來自黑麥胚乳cDNA文庫，其編碼57.7kD的蛋白質(zhì)［17]，而對于小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因的鑒定、克隆及表達研究還未見報道。本研究基于小桐子基因組信息鑒定到1個小桐子SnRK1蛋白激酶α亞基基因，與擬南芥AKIN10同源［18-22]，克隆到了該基因的全長cDNA序列，并對其進行了生物信息學分析、器官與低溫脅迫差異表達及原核表達分析，為研究小桐子SnRK1蛋白激酶在糖信號轉(zhuǎn)導中的功能及抗逆性形成的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用小桐子種子采自云南省元謀縣干熱河谷地區(qū)。選取飽滿的小桐子種子，用1.0%CuSO4消毒20 min，無菌水漂洗5次，置于三角瓶中于26℃培養(yǎng)箱中吸漲24 h，之后無菌水中漂洗3次，播于用無菌水濕潤濾紙的托盤中，于相對濕度75%、溫度26℃、16/8 h光周期的恒溫培養(yǎng)箱中萌發(fā)5 d。將發(fā)芽的種子種植于消毒的培養(yǎng)土中并于同上條件的恒溫培養(yǎng)箱中生長15 d至第2片真葉展開，每天用無菌水澆灌培養(yǎng)土。將生長15 d的小桐子幼苗置于相對濕度75%、溫度12℃、16/8 h光周期的低溫培養(yǎng)箱中進行低溫處理，分別取低溫脅迫0.5、3、12 h與對照（CK，正常培養(yǎng)）的第二片真葉、莖及根，液氮速凍后保存于-80℃冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 小桐子JcSnRK1α基因的克隆 SnRK1α與酵母SNF1和哺乳動物AMPK同源。從GenBank下 載 酵 母 SNF1（AAA35058.1）、 人 類 AMPK（AAB32732.1）、植物中同源基因擬南芥AKIN1.3（NP_198760.1）、AKIN10（AAA32736.1）、AKIN11（BAB01993.1）、水 稻 OSK1（BAA36298.1）、OSK24（BACA56589.1）、 黑 麥（AAA33921.1） 及 煙 草（BAA05649.1）的SnRK1α蛋白序列，以上述序列為種子序列，利用NCBI Blast程序?qū)π⊥┳拥鞍踪|(zhì)數(shù)據(jù)庫進行BlastP相似性檢索（閾值E＜1e-40，序列相似性＞50%），得到候選的小桐子SnRK1α蛋白質(zhì)序列XP_012084751.1，同時，下載其對應基因序列（NW_012124717.1）與 mRNA 序列（XM_01222936.1）。以mRNA序列為基礎設計全長擴增引物（JcSnRK1α_C），上游：5'-CTCTTTGAGCTCGATTGTGTCCATC-3'；下 游：5'-GAAGGACAGTTATTTACACCGTG-3'，菌 落 PCR 驗 證 引 物（JcSnRK1α_T）， 上 游 ：5'-CCTGGTCATCATGAAGG-3'；下游：5'-CCGACGT CGACAAGGACTCGGAGTTGTGCAAGAAAAG-3'，并送深圳華大基因公司合成。

利用TriZol法提取小桐子對照與不同低溫處理下的葉片、莖及根的總RNA，并利用DNase I（TaKaRa公司）消化RNA中的殘余基因組DNA，得到純化的總RNA。分別取1.5 μg總RNA，以Random primer為逆轉(zhuǎn)錄引物，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司）合成第一鏈cDNA。以莖cDNA為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD FX Neo DNA Polymerase（TOYOBO公司）及JcSnRK1α_C引物進行PCR擴增，擴增條件為：98℃預變性5 min；98℃變性10 s，60℃退火30 s，68℃延伸2 min，30個循環(huán)，68℃后延伸5 min。電泳檢測正確的PCR擴增產(chǎn)物20 μL，加1 μL Taq DNA Polymerase（TaKaRa公司），72℃反應 25 min進行加A處理，利用Gel Extraction Kit（OMEGA公司）回收目的基因條帶。將回收基因片段與克隆載體pMD18-T連接，命名為pMD18-T-JcSnRK1α，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂LB抗性平板（包含50 mg/L Amp），過夜生長，進行藍白斑篩選。利用引物JcSnRK1α_T進行菌落PCR驗證的陽性克隆，送深圳華大基因公司進行雙向測序。

1.2.2 小桐子JcSnRK1α基因的序列分析 利用ExPaSy提供的在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對得到的小桐子JcSnRK1α蛋白序列進行氨基酸數(shù)目、理論分子量、等電點等基本參數(shù)的分析。將獲得的小桐子JcSnRK1αcDNA與基因序列利用軟件Splign進行比對以確定基因內(nèi)含子與外顯子的結構，并利用GSDS（Gene Structure Display Server，http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制基因結構圖。利用GenBank CDD（Conserved domains）在線分析工具對JcSnRK1α進行結構域分析。根據(jù)JcSnRK1α的編碼區(qū)序列（Coding sequence，CDS）對小桐子基因組進行Blastn相似性檢索，得到JcSnRK1α基因起始密碼子ATG上游1 500 bp的調(diào)控序列，并通過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其順式作用元件進行鑒定。將克隆到的小桐子JcSnRK1α基因的蛋白序列與其他物種SnRK1α同源序列利用ClustalX 2.0進行序列相似性比對，然后用MEGA 6.0軟件通過鄰接法（NJ）構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 小桐子JcSnRK1α基因的表達分析 利用小桐子各組織及低溫處理材料的cDNA為模板，以18S rRNA為內(nèi)參基因進行JcSnRK1α基因的實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）表達分析。引物序列為：18S rRNA上游：5'-AGAAACGGCTACCACATC-3'、 下 游 ：5'-CCAAGGTCCAACTACGAG-3'，JcSnRK1α（JcSnRK1α_Q）上游 ：5'-GACAACCGATTCCGTGTT-3'、 下 游 ：5'-GAAGTCCAAGTGCCCATT-3'。20 μL反應體系，每個樣品重復3次，儀器為LightCycler96（Roche公司）。擴增條件為：94℃預變性30 s；94℃變性10 s，53℃退火15 s，72℃延伸15 s，45個循環(huán)，之后增加溶解曲線程序：95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s，連續(xù)檢測信號。采用2-ΔΔCt方法進行基因差異表達分析。器官差異表達分析以葉片的表達量為基準，低溫差異表達分析以對照（CK）的表達量為基準。

1.2.4 原核表達載體的構建與目的蛋白的誘導表達 設計帶酶切位點的引物JcSnRK1α_E，上游：5'- CGGGATCCATGGATGGGTCAAATCACCGAAGC AG -3'（下劃線表示BamHI酶切位點）、下游：5'-CCGCTCGAGCTAAAGGACTCGGAGTTGTGC -3'（下劃線表示XhoI酶切位點），擴增小桐子JcSnRK1α基因的全長編碼框序列，擴增產(chǎn)物與原核表達載體pGEX-4T-1經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切，切膠回收后利用T4 DNA連接酶16℃過夜連接，獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-JcSnRK1α，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布LB抗性平板（含50 mg/L的Amp），37℃過夜生長。經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切驗證的陽性克隆，送深圳華大基因公司進行測序。

將構建的小桐子原核表達載體pGEX-4T-1-JcSnRK1α轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株，同時轉(zhuǎn)化pGEX-4T-1空載體作為對照，挑取陽性單克隆接種至5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L的Amp），37℃ 200 r/min過夜振蕩培養(yǎng)。之后按體積比1：100接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中（含50 mg/L的Amp），37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4-0.6，取1 mL菌液作為誘導前對照，4℃保存。加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃誘導表達，分別取誘導1、3、6、12 h的菌液于4℃保存?zhèn)溆谩⑽凑T導與誘導不同時間的菌液12 000 r/min離心5 min，棄上清，在菌體沉淀中加入200 μL PBS緩沖液（pH值7.4）重懸浮，加入50 μL 5×SDS上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，冷卻至室溫，12 000 r/min離心5 min，取20 μL上清蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳（5%濃縮膠，12%分離膠），考馬斯亮藍染色檢測蛋白質(zhì)的表達情況。

2 結果

2.1 小桐子JcSnRK1α基因的克隆

以小桐子莖cDNA為模板，擴增JcSnRK1α基因cDNA全長序列。測序結果（圖1）表明，克隆的小桐子JcSnRK1α基因全長1 700 bp。ORF finder分析表明其包含完整的開放閱讀框1 545 bp，編碼514個氨基酸殘基，結合基因序列分析顯示，在5'與3'端分別包含294 bp與407 bp的5'-UTR與3'-UTR非編碼區(qū)。

將cDNA序列與基因序列（NW_012124717.1）通過Splign進行比對顯示（圖2-A），小桐子JcSnRK1α基因包含11個外顯子與10個內(nèi)含子，且3'端最后一個外顯子與3'-UTR區(qū)域重合。ProtParam計算結果表明，小桐子JcSnRK1α蛋白分子量為58.8 kD，理論等電點為8.57，包含較多的非極性氨基酸，其中Leu、Ile、Val的比例占24.5%。

2.2 小桐子JcSnRK1α基因的結構特征分析

進一步通過GenBank CDD程序?qū)π⊥┳覬cSnRK1α氨基酸序列進行功能結構域分析，確定其屬于小桐子SnRK1蛋白的α亞基，從N端到C端依次鑒定到激酶結構域（Kinase domain）、自抑制調(diào)控結構域（Ubiquitin-associated domain，UBA）及激酶相關結構域 1（Kinase associated domain1，KA1）/β-亞基結合結構域（β-subunit interaction action，β-SID）（圖 2-B）。

將其激酶結構域與其他物種進行比對發(fā)現(xiàn)，除酵母（Saccharomyces cerevisiae）以外，都包含約250 aa氨基酸殘基，序列相似性達到60%以上，其中，在激酶結構域內(nèi)部，還鑒定到ATP結合基序（分布于30-160 aa之間）與保守的磷酸化T-loop區(qū)域（分布于160-190 aa之間）（圖3）。克隆的小桐子SnRK1α激酶結構域位于16-271位（長度256 bp），T-loop區(qū)域位于160-186位（核心Thr175殘基），同時，ATP結合基序中的保守Lys殘基對于SnRK1α結合ATP也是必需的，本研究鑒定的小桐子SnRK1α中保守的Lys殘基位于48位。另外，UBA結構域與KA1結構域分別位于293-333位與390-511位，與擬南芥KIN10的各結構域位置基本一致。

SnRK1α與酵母SNF1、哺乳動物AMPK同屬于SNF1家族激酶，進一步將小桐子SnRK1的T-loop區(qū)域與其他物種進行序列比對并構建系統(tǒng)進化樹，結果（圖4）顯示，同屬雙子葉植物的擬南芥、煙草及小桐子其T-loop區(qū)域序列完全相同，而單子葉植物的水稻與黑麥存在2個氨基酸殘基的差異，SNF1家族的人類AMPK與酵母SNF1單獨聚類為一個分支，酵母SNF1在進化上更為古老，且與其他物種的序列差異性最大，但所有物種T-loop區(qū)域中的保守Thr殘基及其兩側氨基酸完全一致，是SnRK1α家族蛋白受上游信號調(diào)控所必需的。

圖1 小桐子JcSnRK1α基因的cDNA與推導的氨基酸序列

圖2 小桐子JcSnRK1α的基因結構、結構域及順式作用元件分析

SnRK1α是與低能量逆境相關的基因，對小桐子JcSnRK1α基因上游1 500 bp的調(diào)控序列通過PlantCARE在線程序進行順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)了基因啟動子、增強子區(qū)域常見的作用元件，如輔助RNA聚合酶II結合的位點TATA-box，以及控制轉(zhuǎn)錄起始頻率并增強轉(zhuǎn)錄活性的位點CAAT-box。另外，還鑒定到不同的防御與非生物脅迫逆境響應元件如創(chuàng)傷（WUN-motif，AAATTTCCT）、高溫（HSE，AAAAAATTC）、低溫（LTR，CCGAAA）及干旱MYB元件（MBS，TAACTG）等，以及赤霉素應答元件（GARE-motif，AAACAGA）、類黃酮合成基因（Flavonoid biosynthetic gene）響應元件（MBSI，AAAAAACG/CGTTA）（圖 2-C），說明小桐子JcSnRK1α基因的表達受多重信號系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。

圖3 小桐子JcSnRK1α及同源蛋白激酶結構域序列比對

圖4 小桐子JcSnRK1α及同源蛋白T-loop區(qū)域序列比對，箭頭表示保守的Thr殘基

2.3 小桐子JcSnRK1α基因的差異表達分析

在小桐子JcSnRK1α基因的啟動子序列中鑒定到了低溫、高溫、干旱及創(chuàng)傷等非生物脅迫逆境響應元件（圖2-C），通過qRT-PCR技術對JcSnRK1α基因在小桐子不同器官與低溫脅迫處理下的表達特性進行了研究，結果（圖5-A）表明，JcSnRK1α基因在小桐子各器官中都有表達，但存在表達特異性，其中，在莖中表達量較高（較葉片中高31.05倍），其次為根，而在葉片中表達量較低。

低溫脅迫條件下，小桐子JcSnRK1α基因在莖與根中表現(xiàn)出相似的表達變化趨勢，與對照相比，在莖中，在低溫脅迫3 h達到最大表達量，較對照提高2.04倍（P＜0.01），之后表達量迅速下降，且低于對照的表達水平（圖5-B）；而在根中，在低溫脅迫0.5 h出現(xiàn)表達峰值，較對照提高3.16倍（P＜0.01），之后表達量逐漸下調(diào)，且在低溫脅迫12 h時回到對照表達水平（圖5-C），說明JcSnRK1α基因在根中更快速響應低溫脅迫。

2.4 小桐子JcSnRK1α原核表達載體的構建與蛋白表達

將大腸桿菌Rosetta菌株、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空載體與pGEX-4T-1-JcSnRK1α重組載體的菌液裂解后進行SDS-PAGE表達蛋白的電泳分析。結果（圖6）表明，大腸桿菌Rosetta菌株（CK-1）、轉(zhuǎn)pGEX-4T-1空載體（CK-2）及轉(zhuǎn)pGEX-4T-1-JcSnRK1α重組載體未誘導（0 h）的菌株都未出現(xiàn)相應分子量的條帶。而經(jīng)過IPTG誘導1、3、6、12 h的菌株都出現(xiàn)1條約84.8 kD的蛋白條帶（pGEX-4T-1載體的表達標簽為26.0 kD，小桐子JcSnRK1α蛋白預測分子量為58.8 kD），與理論融合蛋白的分子量一致，且隨著誘導時間的延長，蛋白表達量逐漸增加，表明JcSnRK1α基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達。

圖5 小桐子JcSnRK1α基因的器官與低溫脅迫差異表達分析

圖6 小桐子JcSnRK1α基因表達蛋白的SDS-PAGE電泳

3 討論

SnRK1的活性主要受到細胞能量水平的調(diào)節(jié)，但其是否像AMPK一樣受到AMP的激活，還不太清楚［11]。而6-磷酸海藻糖（Trehalose-6-phosphate，T6P）是SnRK1的抑制劑，海藻糖的代謝與SnRK1感應低糖信號之間有重要的聯(lián)系［23]，并且T6P還需要其他介導因子參與完成SnRK1的抑制過程［24]，另外，其他報道顯示，SnRK1的活性還受到Ca2+［25]、6-磷酸葡萄糖（Glucose-6-phosphate）［26]，以及 GRIK1/2（Geminivirus Rap Interacting kinase 1/2）的調(diào)節(jié)［27]，其中 GRIKs被認為是磷酸化 SnRK1α T-loop中保守Thr殘基的核心蛋白激酶［19]。而在小桐子的SnRK1α基因啟動子中還鑒定到類黃酮合成基因響應相關順式作用元件（圖2C），表明其還受到類黃酮類化合物的調(diào)節(jié)。

植物中SnRK1是糖代謝網(wǎng)絡、依賴或不依賴miRNA的能量代謝［28-29]、糖信號轉(zhuǎn)導、ABA信號轉(zhuǎn)導的關鍵因子，能夠調(diào)節(jié)編碼糖代謝關鍵基因的時空表達特性，同時也可通過磷酸化特定SAMS序 列（-HMRSAMSGLHLVKR-） 的Ser殘基調(diào)節(jié)一系列酶的活性［30]。本研究對小桐子全蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行相似性檢索，也鑒定到包含SAMS序列的糖代謝相關酶，如D-3-磷酸甘油 酸 脫 氫 酶（D-3-phosphoglycerate dehydrogenase，XP_012068288.1）、焦磷酸：果糖 -6-磷酸 1-磷酸 轉(zhuǎn) 移 酶（Pyrophosphate：fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase，XP_012073552.1）、 木 糖 葡聚糖葡基轉(zhuǎn)移酶（Xyloglucan glycosyltransferase，XP_012085176.1），也證明SnRK1與小桐子的糖代謝信號網(wǎng)絡密切相關。

另外，SnRK1對植物發(fā)育與抗逆相關基因表達也有影響。反義表達SnRK1α的豌豆植株表現(xiàn)出了多種成熟缺陷，如淀粉含量降低、花粉粒變小以及敗育等［30-31]，Halford 等推測是由于轉(zhuǎn)化酶（Inverase）不能被激活，導致不能利用攝入的蔗糖，最終花粉粒因不能響應“高蔗糖/低葡萄糖”能量狀態(tài)信號，從而在含有蔗糖的培養(yǎng)基上饑餓而敗育［5，7，32-33]，同時，在馬鈴薯中反義表達GAI83（SnRK1復合體的β亞基）的同源基因StubGAI83，導致轉(zhuǎn)基因植株對高鹽敏感，并且影響主根的生長［15]，相反，在煙草中過表達SnRK1α基因可明顯提高煙草對病毒的抗性［16]。本研究在小桐子SnRK1α基因的啟動子中也鑒定到大量的逆境響應元件如低溫響應元件，qRT-PCR實驗也驗證了該基因參與小桐子的低溫脅迫響應過程，與小桐子抗冷性的形成直接相關，但該基因在根中響應低溫脅迫（0.5 h）顯著快于莖（3 h）中，且上調(diào)表達量也高于莖中，暗示SnRK1α基因在根中響應低溫脅迫更加敏感，同時，在莖中，隨著低溫脅迫的持續(xù)，SnRK1α基因的表達量迅速下調(diào)，且顯著低于對照表達水平，推測該基因在莖中受到更多上游信號分子的表達調(diào)節(jié)作用。以上結果表明SnRK1處于調(diào)控網(wǎng)絡的核心位置，受到上游信號分子如激酶的調(diào)節(jié)，同時通過磷酸化/去磷酸化共價修飾調(diào)節(jié)參與感知細胞能量狀態(tài)轉(zhuǎn)錄因子的信號放大過程、碳氮代謝關鍵基因的表達與活性調(diào)節(jié)過程以及抗逆信號轉(zhuǎn)導過程等，為小桐子SnRK1α基因在其他生物與非生物逆境脅迫下的差異表達分析與異源轉(zhuǎn)化功能驗證等后續(xù)研究工作奠定了基礎。

4 結論

本研究克隆到小桐子JcSnRK1α基因1 700 bp cDNA，包含完整開放閱讀框1 545 bp，編碼514個氨基酸。從N端到C端具備激酶結構域、自抑制調(diào)控結構域及激酶相關結構域。該基因啟動子區(qū)域鑒定到低溫等非生物脅迫應答元件，參與小桐子抗冷性過程。表達分析顯示，JcSnRK1α在小桐子莖與根中表達量較高，且都屬于低溫誘導上調(diào)表達基因。另外，構建該基因的原核表達載體并成功誘導表達，得到84.8 kDa的融合蛋白條帶。