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    亞硝酸鹽脅迫對草魚肝臟泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響

    2019-07-26 06:58:20孫怡晴ONXAYVIENGKommaly李大鵬
    淡水漁業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:蛋白酶體泛素草魚

    孫怡晴,梁 驍,熊 梅,ONXAYVIENG Kommaly ,2,湯 蓉,李大鵬

    (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;2.家畜和漁業(yè)部,農(nóng)林部,老撾萬象 6644)

    亞硝酸鹽是生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)的重要中間產(chǎn)物,也是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中常見的污染物。在池塘精養(yǎng)過程中,由于投餌量大以及殘餌糞便大量沉積會(huì)產(chǎn)生大量的氨,缺氧時(shí)硝化作用受阻,會(huì)引起亞硝酸鹽在水環(huán)境中積累。養(yǎng)殖水體中較高濃度的亞硝酸鹽通常會(huì)對魚類引起毒理效應(yīng),導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng),危害養(yǎng)殖魚類存活和健康。環(huán)境應(yīng)激通常會(huì)直接或間接地引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的改變,影響動(dòng)物的生長和發(fā)育。

    在脊椎動(dòng)物中,有三個(gè)主要的系統(tǒng)對蛋白質(zhì)降解起關(guān)鍵作用,即泛素-蛋白酶體系統(tǒng),溶酶體自噬系統(tǒng)和鈣蛋白酶系統(tǒng)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)[1]。UPS降解細(xì)胞內(nèi)聚集的或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、代謝、免疫應(yīng)答、信號傳遞、轉(zhuǎn)錄控制、應(yīng)激應(yīng)答等生物學(xué)過程[2]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)由泛素(Ub)、泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)、泛素連接酶(E3)和26S蛋白酶體等組成。泛素化是一個(gè)ATP依賴型的耗能過程,主要包括兩個(gè)步驟:首先,通過E1、E2、E3使目標(biāo)蛋白與泛素形成一條多聚泛素鏈;其次,多聚泛素鏈被26S蛋白酶體識別并降解為小肽或氨基酸[3]。E3連接酶可以對不同的底物進(jìn)行特異性的識別,表現(xiàn)了蛋白降解的高度選擇性。

    UPS的核心組分可以作為應(yīng)激傳感器直接參與應(yīng)激感知,如E3連接酶CRL3KEAP1、SCFMET30和SCFFBXL5。Nrf2是由E3連接酶調(diào)控的典型轉(zhuǎn)錄因子,同時(shí)是氧化應(yīng)激的重要傳感器[4]。各種應(yīng)激條件如熱、滲透、氧化和重金屬引起的應(yīng)激反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致蛋白損傷,從而引起蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊。作為第一反應(yīng),不同的伴侶系統(tǒng)(如HSP70、HSP90)嘗試重新折疊蛋白;當(dāng)重折疊不成功時(shí),這些蛋白通過CHIP(E3)的作用被UPS降解[5]。研究表明,生活在0 ℃以下的南極魚類鰓和肝臟中20S蛋白酶體活性隨著溫度升高而增強(qiáng)[6]。在酵母中的研究結(jié)果表明蛋白酶體與Hul5(HECT型泛素連接酶)在清除細(xì)胞質(zhì)內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)揮積極作用[7]。

    草魚(Ctenopharyngodonidellus)是我國主要的大宗淡水養(yǎng)殖種類,也是世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的水產(chǎn)品種。急性亞硝態(tài)氮濃度的升高會(huì)使草魚免疫性能下降、氧化應(yīng)激反應(yīng)加強(qiáng)[8]、甲狀腺激素代謝平衡被擾亂及甲狀腺功能減退[9]。雖然泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在魚類蛋白質(zhì)代謝中具有重要的作用,但亞硝酸鹽脅迫對魚類該系統(tǒng)的影響目前了解甚少。本研究以草魚幼魚為實(shí)驗(yàn)對象,進(jìn)行亞硝酸鹽的急性脅迫實(shí)驗(yàn),探究亞硝酸鹽脅迫對草魚肝臟泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的影響,旨在為養(yǎng)殖環(huán)境控制和提升養(yǎng)殖魚類品質(zhì)提供基礎(chǔ)科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)魚與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

    實(shí)驗(yàn)用草魚(94.88±16.54 g)購自湖北省黃岡市團(tuán)風(fēng)縣百容良種場,實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)1周,養(yǎng)殖用水為曝氣的自來水。實(shí)驗(yàn)采用亞硝酸鈉溶液作為亞硝酸鹽脅迫溶液,設(shè)置對照組和實(shí)驗(yàn)組,對照組亞硝酸鈉濃度為0 mg/L,實(shí)驗(yàn)組暴露濃度為0.5 mg/L和20 mg/L。在暴露12、24 、48和96 h后,分別從每組采集8尾魚麻醉(MS-222,250 mg/L)后采集組織樣品,用于生物化學(xué)、組織學(xué)、分子生物學(xué)的檢測。實(shí)驗(yàn)期間,水溫24.0~26.0 ℃,pH值為7.5±0.3,24 h連續(xù)曝氣,溶氧保持在7 mg/L以上,每12 h更換試液一次以保證實(shí)驗(yàn)暴露濃度的穩(wěn)定性。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 血液生化指標(biāo)測定

    葡萄糖(GLU)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、膽固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)在全自動(dòng)生化分析儀(Selectra XL,荷蘭威圖科學(xué)公司)上測定,試劑盒購自武漢康瑞嘉科技有限公司。皮質(zhì)醇的測定采用放射性免疫法(RIA),試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。

    1.2.2 相關(guān)基因表達(dá)水平檢測

    總RNA提取及cDNA合成:取約80 mg樣品使用Trizol(Vazyme)提取總RNA,在1.1%瓊脂糖凝膠電泳中檢測樣品RNA完整性,并通過分光光度計(jì)法測定濃度。使用帶有g(shù)DNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara)的PrimeScript RT試劑盒,根據(jù)說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。

    基因的引物設(shè)計(jì):根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列,使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)。選用β-actin為實(shí)時(shí)熒光定量PCR內(nèi)參基因,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選取psma2(20S proteasome subunit alpha type 2)和psmc1(26S proteasome subunit ATPase 1)分別代表26S 蛋白酶體的20 S亞基和19 S亞基。

    實(shí)時(shí)熒光定量PCR:反應(yīng)體系包括10 μL HieffTMqPCR SYBRGreen Master Mix(No Rox Plus)(YEASEN),各0.4 μL上、下游引物,7.2 μL雙蒸水,2 μL cDNA模板,在QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Detection System(Applied Biosystems,USA)進(jìn)行熒光定量反應(yīng)。反應(yīng)程序:首先95 ℃預(yù)變性5 min,再進(jìn)行95 ℃變性10 s,57 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環(huán)40次。

    表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

    1.2.3 泛素化蛋白含量測定

    使用Dot-Blot 方法測定肝臟組織泛素化蛋白含量。用RIPA 裂解緩沖液(廣州捷倍斯生物科技有限公司)提取肝臟中的總蛋白,BCA蛋白測定試劑盒(廣州捷倍斯生物科技有限公司)測定濃度,PBS調(diào)節(jié)樣品蛋白濃度,使?jié)舛缺3忠恢?0.67 μg/μL)。移取100 μL樣品至Bio-Dot(Bio-Rad),通過抽濾裝置將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(Millipore)。將NC膜置于封閉液中孵育1 h以阻斷非特異性結(jié)合,然后多聚泛素化蛋白抗體(FK1)(Biomol,BML-PW8805-0500)4 ℃孵育過夜。FITC標(biāo)記的二抗(BOSTER,BA1101)孵育2 h后,通過Odyssey CLx(LI-COR,CLx-0813)顯影分析,使用Image J讀取各斑點(diǎn)灰度值。

    1.2.4 肝臟組織學(xué)觀察

    實(shí)驗(yàn)96 h后,采集20 mg/L暴露組草魚肝臟樣品保存于多聚甲醛中,制作石蠟組織切片,用蘇木素-伊紅染色。在Nikon Eclipse 80i顯微鏡下觀察組織學(xué)結(jié)構(gòu),并進(jìn)行拍照分析。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

    基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算,采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),當(dāng)P<0.05時(shí),差異顯著。使用Graphpad PrismV5.0作圖。

    2 結(jié)果

    2.1 血液生化指標(biāo)

    由圖1-A可知,在實(shí)驗(yàn)12、24和48 h時(shí),亞硝酸鹽脅迫顯著提高了草魚血清皮質(zhì)醇含量;在96 h時(shí)恢復(fù)至對照水平。在0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫下,血清葡萄糖的含量在24、48和96 h時(shí)均出現(xiàn)顯著性下降(圖1-B)。血清中膽固醇的含量在亞硝酸鹽脅迫期間,無顯著性變化(圖1-C)。在0.5 mg/L暴露組,甘油三酯和總蛋白的含量在24 h顯著降低(圖1-D、E)。在0.5 mg/L暴露組,血清中白蛋白含量在24 h顯著低于對照組,在48 h和96 h顯著高于對照組(圖1-F)。

    圖版1 亞硝酸鹽暴露對草魚幼魚血清生化指標(biāo)的影響Plt.1 Serum biochemical parameters of C.idellus juveniles exposed to different nitrite concentration*表示同一暴露時(shí)間內(nèi)與0 mg/L組比較有顯著差異(P<0.05),結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤的形式表示(n=8),圖版2、圖版3同。

    20 mg/L亞硝酸鹽脅迫24 h后ALP的含量顯著性升高(圖1-G)。在0.5 mg/L暴露組中,血清中ALT含量與暴露時(shí)間負(fù)相關(guān),在12 h與24 h顯著性升高,在48 h與96 h顯著性降低。在20 mg/L暴露組中,其含量在48 h和96 h顯著性低于對照組(圖1-H)。20 mg/L亞硝酸鹽脅迫24 h時(shí),血清AST的含量顯著升高;但在12 h及96 h時(shí),其含量顯著降低。0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫12 h時(shí),AST含量顯著高于對照水平;在48 h和96 h時(shí),其含量與對照組相比顯著降低(圖1-I)。

    2.2 Nrf2 和hsp70的表達(dá)

    20 mg/L亞硝酸鹽脅迫下,nrf2的表達(dá)量在12 h與48 h出現(xiàn)顯著性升高;在0.5 mg/L暴露組,其表達(dá)量在24 h顯著降低,在48 h顯著升高(圖2-A)。在20 mg/L暴露組,hsp70的表達(dá)量在12、24和48 h均顯著性升高,在96 h恢復(fù)至對照水平;在0.5 mg/L暴露組,hsp70的表達(dá)量在12、48和96 h顯著升高,在24 h其表達(dá)量顯著低于對照組(圖2-B)。

    圖版2 亞硝酸鹽暴露對草魚幼魚肝臟nrf2,hsp70相對表達(dá)量的影響Plt.2 Relative expression of nrf2 and hsp70 in the liver of C.idellus exposed to nitrite基因的表達(dá)量以0 mg/L組為1。

    2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性

    圖版3 草魚幼魚肝臟UPS相關(guān)基因的相對表達(dá)量和泛素化蛋白的相對含量Plt.3 Relative expression of genes and ubiquitinated proteins in the liver of grass carp 泛素化蛋白的表達(dá)量以0 mg/L組為1。

    在20 mg/L暴露組,chip的mRNA水平在12、24和48 h顯著升高,在96 h與對照組相比無顯著不同(圖3-A)。Ub的表達(dá)量在亞硝酸鹽脅迫的不同時(shí)間點(diǎn)均存在劑量依賴式上升(圖3-B);0.5 mg/L暴露組,其表達(dá)量在24 h和48 h顯著降低,在12 h和96 h顯著性升高;在20 mg/L暴露組中ub的表達(dá)水平均顯著高于對照組。在20 mg/L暴露組,psma2的mRNA水平在24 h顯著升高,在48 h顯著下降;0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫使psma2表達(dá)量在12 h顯著升高,24 h和48 h顯著降低(圖3-C)。psmc1的mRNA水平在0.5 mg/L脅迫48 h顯著降低;在20 mg/L脅迫24 h其表達(dá)水平顯著升高,在48 h顯著降低(圖3-D)。在0.5 mg/L亞硝酸鹽脅迫12、48和96 h,肝臟泛素化蛋白的含量顯著性升高。在20 mg/L暴露組中,泛素蛋白含量在12、24和96 h顯著高于對照組(圖3-E)。

    2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察

    由圖4-A可觀察到,對照組的肝細(xì)胞形狀正常,總體形態(tài)規(guī)律,細(xì)胞核位置明顯;而草魚肝細(xì)胞在20 mg/L的亞硝酸鹽脅迫96 h后,肝細(xì)胞出現(xiàn)明顯脂肪空泡化現(xiàn)象(圖4-B)。

    圖4 20 mg/L亞硝酸鹽暴露96 h對草魚幼魚肝臟的組織學(xué)影響Fig.4 The hepatic histological change in grass carp exposed to 20 mg/L of nitrite for 96 h.A:對照組;B:暴露組;HE×200。

    3 討論

    3.1 血清生化指標(biāo)

    魚類的血液承擔(dān)機(jī)體營養(yǎng)代謝和信息傳遞的重要作用,在生理學(xué)研究中,可以通過魚類血液生化指標(biāo)的變化來衡量其應(yīng)激水平、營養(yǎng)狀況、代謝狀態(tài)等。皮質(zhì)醇的含量變化作為檢測應(yīng)激反應(yīng)重要的指標(biāo)之一,在魚體受到外界環(huán)境刺激后,通過下丘腦-垂體-腎間組織軸(HPI)分泌,可幫助機(jī)體對抗環(huán)境應(yīng)激[10]。草魚在高濃度的亞硝酸鹽脅迫短時(shí)間內(nèi)血清皮質(zhì)醇含量上升,表明草魚產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng),實(shí)驗(yàn)后期已恢復(fù)至對照水平,在鳙(Aristichthysnobilis)的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果[11],大菱鲆(Scophthalmusmaximus)在急性的亞硝酸鹽暴露下血清皮質(zhì)醇水平也顯著升高[12]。有研究指出,亞硝酸鹽脅迫可以通過激活HPI軸使皮質(zhì)醇分泌增多,從而提高葡萄糖水平[13]。本實(shí)驗(yàn)中,0.5 mg/L亞硝酸鹽暴露組的葡糖糖含量在24、48、96 h均呈現(xiàn)顯著下降,這可能是由于魚體內(nèi)能量物質(zhì)的大量消耗。在暗紋石斑魚(Sebastesinermis)的研究中也發(fā)現(xiàn)血清中葡萄糖的含量隨著亞硝酸鹽暴露時(shí)間的延長而明顯下降[14]。

    甘油三酯和膽固醇作為魚類脂質(zhì)代謝中的重要物質(zhì),在抵抗外界環(huán)境應(yīng)激的時(shí)候發(fā)揮重要作用,堿性磷酸酶是一種代謝調(diào)節(jié)酶,可以促進(jìn)魚體營養(yǎng)的吸收和利用[11],亞硝酸鹽暴露濃度及時(shí)間對草魚血清中甘油三酯,膽固醇和堿性磷酸酶影響不大。在本研究中0.5 mg/L的亞硝酸鹽脅迫提高了血清中白蛋白的含量,白蛋白作為血清中主要的蛋白質(zhì)成分能夠維持滲透壓平衡[15]。

    谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝臟、心肌組織中的重要轉(zhuǎn)氨酶,在正常生理狀態(tài)下,這些酶在血清中活性穩(wěn)定,當(dāng)肝細(xì)胞受應(yīng)激等引起病變或損傷時(shí),組織細(xì)胞膜的通透性增加,細(xì)胞內(nèi)的這兩種酶釋放到血液中。鳙在48.634 mg/L亞硝酸鹽氮暴露下其血清中這兩種酶的含量在48 h顯著升高,在恢復(fù)12 h 后達(dá)到對照水平[11]。強(qiáng)俊等[15]發(fā)現(xiàn)高溫脅迫尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)12 h 后,其血清中這兩種酶的含量顯著上升并在脅迫24 h 后降低。本實(shí)驗(yàn)中草魚血清谷草、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量先升高后下降,可能是因?yàn)槎唐趦?nèi)亞硝酸鹽脅迫會(huì)使肝臟損傷加重,而脅迫后期,魚體基本適應(yīng)脅迫環(huán)境。

    3.2 肝臟hsp70 和nrf2的相對表達(dá)

    通常,除了血液中皮質(zhì)醇及葡萄糖的含量,HSP70和Keap1-nrf2通路的表達(dá)水平也可以反映魚類的應(yīng)激狀態(tài)[16]。在魚類中,熱休克蛋白(HSPS)的調(diào)控受機(jī)體本身的遺傳特性與外界環(huán)境的共同影響,HSP70可以作為分子伴侶參與細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成,以及對錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)、降解[15,17]。在本實(shí)驗(yàn)中,hsp70在肝臟中的表達(dá)量受高濃度亞硝酸鹽脅迫影響巨大。草魚受到亞硝酸鹽的脅迫后,hsp70 mRNA被誘導(dǎo)高表達(dá)以保護(hù)魚體減小損傷,環(huán)境應(yīng)激引起機(jī)體hsp70 mRNA表達(dá)上升可以在許多研究中發(fā)現(xiàn)。例如,大菱鲆在亞硝酸鹽脅迫96 h后血液中的hsp70的表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)[12],團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)在34 ℃的熱應(yīng)激條件下其肝臟hsp70基因的表達(dá)量在6 h達(dá)最高,隨后開始下降[18]。除了熱休克蛋白,氧化應(yīng)激反應(yīng)同樣受到抗氧化轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)節(jié),通過Nrf2/ARE通路,激活靶基因,積極發(fā)揮抗氧化作用[19]。Nrf2的表達(dá)趨勢與hsp70相似,在高濃度亞硝酸鹽脅迫短期內(nèi)大幅度上調(diào),96 h后恢復(fù)至對照水平,與鎘脅迫斑馬魚(Daniorerio)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似,這可能與抗氧化基因的增強(qiáng)密切相關(guān)[20]。葉元土等[21]發(fā)現(xiàn),灌喂氧化魚油顯著改變了草魚“Keap1-Nrf2-ARE”調(diào)控的下游靶向通路,谷胱甘肽/谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、熱休克蛋白和蛋白質(zhì)泛素化通路的基因均顯著性上調(diào),用于清除氧化損傷的物質(zhì)和修復(fù)氧化損傷的細(xì)胞等。

    3.3 UPS活性的檢測

    在應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生的錯(cuò)誤折疊蛋白與未折疊蛋白首先被HSP70等熱休克蛋白重新折疊,當(dāng)HSP70不能對其進(jìn)行重新折疊時(shí),CHIP作為HSP70的分子伴侶及重要的E3連接酶,可以識別HSP70-底物復(fù)合物,誘導(dǎo)該底物蛋白多聚泛素化并被UPS降解[5,17]。草魚肝組織中chip的表達(dá)趨勢與hsp70和nrf2的基本一致。我們發(fā)現(xiàn)肝臟中ub的表達(dá)量與亞硝酸鹽的脅迫濃度有顯著的正相關(guān);psmc1和psma2的表達(dá)水平在20 mg/L亞硝酸鹽脅迫下在24 h顯著升高,因此UPS的活性在亞硝酸鹽脅迫短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)顯著的增強(qiáng)。有文獻(xiàn)指出溫度升高10 ℃顯著提高了南極魚類的肝臟及鰓組織中20S蛋白酶體活性[6];藍(lán)綠光鰓魚(Chromisviridis)在高溫暴露12 h后,其血糖水平、鰓熱休克蛋白及泛素化蛋白的含量出現(xiàn)顯著上升[22]。本實(shí)驗(yàn)中亞硝酸鹽脅迫提高了草魚肝臟中的泛素化蛋白含量。當(dāng)草魚腸道黏膜受到嚴(yán)重的氧化損傷后,它產(chǎn)生許多損傷細(xì)胞及損傷蛋白質(zhì),從而激活黏膜細(xì)胞中泛素蛋白酶體系統(tǒng)和熱休克蛋白顯著上調(diào),以清除損傷或錯(cuò)誤蛋白[21]。

    3.4 組織病理學(xué)變化

    魚類肝臟在調(diào)控基礎(chǔ)代謝、降解與排泄外源有毒物質(zhì)中發(fā)揮重要作用,并且可以作為魚體健康狀況的指示性參數(shù),肝臟對于外界環(huán)境污染物特別敏感,這種敏感表現(xiàn)在肝臟組織所產(chǎn)生的實(shí)質(zhì)性的變化[23]。本實(shí)驗(yàn)中,肝臟在高濃度亞硝酸鹽脅迫96 h后出現(xiàn)明顯的空泡化,鯰(Clariasgariepinus)和團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)在亞硝酸鹽脅迫下其肝臟也表現(xiàn)相似的損傷[24-25]。Saraste等[26]認(rèn)為,肝臟中細(xì)胞凋亡引發(fā)的一些形態(tài)學(xué)特征變化可能導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)的不規(guī)則,脂滴和空泡的形成。肝臟的抗氧化狀態(tài)與肝組織學(xué)存在一致性變化,在肝臟的解毒過程中可能產(chǎn)生ROS并導(dǎo)致對機(jī)體的氧化損傷。Zhang 等[27]發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗氧化系統(tǒng)不能及時(shí)消除肝臟中過量的ROS時(shí),為避免羰基蛋白(CP)的積累造成氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)加劇,組織中酶催化活性被降低,最終引起蛋白酶作用加強(qiáng),加快降解蛋白質(zhì)。

    綜上所述,急性亞硝酸鹽脅迫導(dǎo)致草魚產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),肝臟hsp70、nrf2的表達(dá)量顯著上升,造成了肝臟細(xì)胞損傷;泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的活性加強(qiáng),通過清除損傷或錯(cuò)誤蛋白來降低氧化損傷風(fēng)險(xiǎn)。

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