達(dá)氏鰉谷氨酸脫氫酶基因的克隆及雙低菜粕添加對(duì)其表達(dá)的影響

岳華梅，吳金平，陳細(xì)華，阮 瑞，李創(chuàng)舉

(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

近年來(lái)，隨著魚粉價(jià)格的不斷上升，利用廉價(jià)蛋白源替代魚粉已經(jīng)成為當(dāng)前魚類營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[1]。雙低菜籽粕是雙低油菜籽經(jīng)制油加工后的副產(chǎn)品。油菜籽中通常含有30%～40%的菜油，經(jīng)榨取后可產(chǎn)生70%左右的餅粕。但是因其含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子和毒素，如單寧酸、芥子油甙等, 可影響氨基酸的利用、消化酶的活性、礦物鹽的利用，限制了菜粕在魚類飼料中的使用量[2]。研究表明，烏蘇鱧(Pseudobagrusussuriensis)[3]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[4]和歐洲鰉(Husohuso)[5]對(duì)雙低菜粕的表觀消化率低于魚粉。這可能是由于雙低菜粕屬于植物性蛋白原料，其纖維素所占比例較高，而水生動(dòng)物缺乏消化纖維素的酶系統(tǒng)[6]。當(dāng)飼料中選用植物性蛋白原料(如雙低菜粕)時(shí)，其是否影響魚類的蛋白質(zhì)代謝目前研究較少。

飼料在體內(nèi)蛋白酶的作用下水解生成多肽，多肽在肽酶(如氨肽酶N)的作用下水解生成小肽及游離氨基酸，最后被腸道轉(zhuǎn)運(yùn)載體(如小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體)吸收進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)。谷氨酸脫氫酶(GDH)是蛋白質(zhì)分解代謝和非必需氨基酸合成的關(guān)鍵酶，其活性與蛋白質(zhì)合成與分解有直接關(guān)系[7]。GDH 是通過(guò)催化體內(nèi)氨基酸氧化脫氨基作用來(lái)參與蛋白質(zhì)的分解，具體作用是催化谷氨酸氧化脫氨基生成α-酮戊二酸和氨，其輔酶是NAD+或NADP，也可以催化其逆反應(yīng)參與蛋白質(zhì)的合成[8]。

達(dá)氏鰉(H.dauricus)隸屬鱘形目鱘科鰉屬，主要分布于我國(guó)黑龍江阿穆爾河流域，成魚個(gè)體較大，屬偏肉食性魚類。近些年來(lái)隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，達(dá)氏鰉及其雜交種也作為經(jīng)濟(jì)魚類在全國(guó)范圍內(nèi)開展推廣養(yǎng)殖[9]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，達(dá)氏鰉幼魚對(duì)雙低菜粕的粗蛋白及總氨基酸的表觀消化率顯著低于魚粉[10]。本研究旨在克隆蛋白質(zhì)代謝關(guān)鍵基因谷氨酸脫氫酶，分析其序列及組織表達(dá)特征，并試圖從分子層面探究雙低菜粕是否影響達(dá)氏鰉幼魚的蛋白質(zhì)代謝途徑，以期為菜粕在鱘魚飼料配方中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

所配制飼料配方及營(yíng)養(yǎng)成分見表1。實(shí)驗(yàn)原料魚粉和雙低菜粕來(lái)自武漢大北農(nóng)水產(chǎn)科技有限公司。所有原料粉碎后過(guò)60目篩，在基礎(chǔ)飼料中添加0.4%的二氧化鈦?zhàn)鳛闃?biāo)記物，采用逐級(jí)混勻法，均勻混合到基礎(chǔ)飼料中，以測(cè)定其表觀消化率[10]。取70%添加二氧化鈦的基礎(chǔ)飼料和30%的菜粕，充分混勻后，添加20%左右的水，再次混勻，用小型絞肉機(jī)制成直徑約3 mm的條狀飼料。風(fēng)扇吹干后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干重)

注：*每千克飼料中含有維生素：VB150 mg，VB2200 mg，VB650 mg，VB1220 mg， 葉酸15 mg，VC(30%) 325 mg，泛酸400 mg，肌醇1500 mg，D-生物素(2%) 5 mg，煙酸750 mg，VA 2.5 mg，VE(50%) 100 mg，VD32 mg，VK 20 mg。

**每千克飼料中含有礦物鹽：Ca(H2PO4)21 800 mg，KH2PO41 350 mg，NaCl 500 mg，MgSO4·7H2O 750 mg，NaH2PO4、2H2O 650 mg，KI 1.5 mg，COSO4·6H2O 2.5 mg，CuSO4·5H2O 15 mg， ZnSO4·7H2O 350 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 250 mg，MnSO4·4H2O 80 mg，Na2SeO36.00 mg。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖及樣品采集

達(dá)氏鰉幼魚來(lái)源于黑龍江撫遠(yuǎn)江段野生個(gè)體自然繁殖，所得魚苗隨后飼養(yǎng)于長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所荊州太湖基地。挑選初始體重為(66.79±2.18 g)的達(dá)氏鰉幼魚120尾，隨機(jī)分養(yǎng)于6個(gè)流水養(yǎng)殖桶中(直徑105 cm，體積0.43 m3)，每桶放魚20尾，其中3桶魚飼喂基礎(chǔ)飼料組飼料，另外3桶魚飼喂菜粕組飼料。經(jīng)基礎(chǔ)飼料投喂2周后，開始用實(shí)驗(yàn)飼料投喂，每天表觀飽食投喂2次(08:00，15:00)。實(shí)驗(yàn)期間采取自然光照，水源為過(guò)濾后的地下水，水溫18.2～20.0 ℃，溶氧≥5 mg/L，pH 7.8～8.2。實(shí)驗(yàn)飼料共投喂4周，取樣前對(duì)實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行24 h饑餓處理，然后隨機(jī)選取4條魚，經(jīng)0.05% MS-222(Sigma)麻醉后，解剖取肝臟和腸組織，保存于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放備用。組織表達(dá)分析所選用達(dá)氏鰉為9月齡(體長(zhǎng)35 cm，體重585.4 g)，分別取心、肝、脾、肌肉、腸、下丘腦、垂體組織，浸泡于RNAlater(Qiagen)保存液中，-80 ℃存放備用。

1.3 總RNA 提取

采用RNeasyPlus Mini Kit 試劑盒(Qiagen)進(jìn)行組織總RNA 的提取，并參照PrimeScriptRT reagent Kit With gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒合成單鏈cDNA 用于熒光定量PCR分析。

1.4 谷氨酸脫氫酶基因ORF序列克隆及分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已有的達(dá)氏鱘下丘腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未發(fā)表數(shù)據(jù))，搜索得到gdh同源基因的序列片段信息，設(shè)計(jì)嵌套引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物純化后連入pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。本研究所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表2)。采用NCBI Conserved Domain Database對(duì)所得序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)。對(duì)推導(dǎo)的達(dá)氏鰉GDH氨基酸序列與NCBI中查詢得到的其它物種GDH序列運(yùn)用Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)進(jìn)行序列一致性比對(duì)，并利用MEGA X 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，自展法(Bootstrap)檢驗(yàn)系統(tǒng)分支的置信度(重復(fù)次數(shù)為1 000)。所選取物種GDH氨基酸序列對(duì)應(yīng)的NCBI序列號(hào)如下：人(CAA30521.1)、小鼠(EDL24875.1)、西部錦龜(XP_005294054.1)、綠海龜(EMP30951.1)、熱帶爪蟾(AAH84455.1)、非洲爪蟾(NP_001087023.1)、斑馬魚(NP_997741.1)、泥鰍(AEX31556.1)、黃鱔(AEX31558.1)、大西洋鮭(NP_001117108.1)、虹鱒(CAD11803.1)、羅氏沼蝦(ATN39850.1)、中華絨螯蟹(AEO72077.1)、凡納濱對(duì)蝦(ACC95446.1)。

表2 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)所得到達(dá)氏鰉gdhcDNA 序列設(shè)計(jì)定量引物(表2)，進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。達(dá)氏鰉apN及pepT1基因的熒光定量引物設(shè)計(jì)參考自達(dá)氏鱘下丘腦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到的相應(yīng)同源基因的部分片段序列，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。達(dá)氏鰉hsp90和18sRNA的熒光定量引物參考文獻(xiàn)[11]。實(shí)驗(yàn)按SYBRPremix ExTaqTM(Perfect Real Time)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，重復(fù)3次，以達(dá)氏鰉18S RNA作為內(nèi)參基因。擴(kuò)增反應(yīng)在 Bio-Rad CFX96 Real Time System 儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，并采用SPSS 22.0對(duì)各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P≥0.05表示沒有顯著性差異。使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果

2.1 達(dá)氏鰉谷氨酸脫氫酶基因的cDNA序列擴(kuò)增及分析

本研究克隆得到達(dá)氏鰉谷氨酸脫氫酶基因gdh的完整ORF序列。該序列全長(zhǎng)1 635 bp，編碼544個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，達(dá)氏鰉GDH擁有兩個(gè)ELFV_dehydrog超家族結(jié)構(gòu)域(圖1，下劃線標(biāo)示)。氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果表明，達(dá)氏鰉GDH的氨基酸序列較為保守，與其它代表性脊椎動(dòng)物的同源蛋白序列一致性均大于85%(圖2)。進(jìn)一步運(yùn)用Mega X軟件構(gòu)建了基于GDH氨基酸序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，結(jié)果顯示，哺乳類代表物種人和小鼠先與爬行類的西部錦龜聚為一支，然后再與兩棲類的熱帶爪蟾及非洲爪蟾聚為一支，隨后這5個(gè)物種再與軟骨魚類達(dá)氏鰉聚為一類，而所有的硬骨魚類聚為單獨(dú)的一支。

圖1 達(dá)氏鰉gdh的ORF cDNA全長(zhǎng)序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 The full-length ORF cDNA sequences of gdh and their putative amino acidsELFV_dehydrog結(jié)構(gòu)域用下劃線標(biāo)示

2.2 谷氨酸脫氫酶基因gdh的組織表達(dá)分析

采用熒光定量PCR法檢測(cè)了gdhmRNA在達(dá)氏鰉各組織(心、肝、脾、腸、肌肉、下丘腦、垂體)中的表達(dá)。gdh在所有檢測(cè)的組織中都有表達(dá)，其中在腸中的轉(zhuǎn)錄水平最高，在肌肉中的轉(zhuǎn)錄水平最低(圖4)。

2.3 雙低菜粕添加對(duì)gdh、apN、pepT1及hsp90基因表達(dá)的影響

在基礎(chǔ)飼料中添加雙低菜粕作為蛋白原料制備飼料投喂達(dá)氏鰉幼魚，檢測(cè)其對(duì)蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因gdh、apN、pepT1及應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因hsp90表達(dá)的影響。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，在肝臟中，gdh和hsp90的表達(dá)量在菜粕組和基礎(chǔ)飼料組沒有明顯變化(圖5A)。而在腸中，菜粕組gdh和apN基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于基礎(chǔ)飼料組；pepT1基因在菜粕組的表達(dá)量雖也高于基礎(chǔ)飼料組，但是差異不顯著(圖5B)。

圖2 達(dá)氏鰉與其他代表性物種的GDH氨基酸序列多重比對(duì)分析Fig.2 Multiple sequence alignment of GDH between H. dauricus and other vertebrates除達(dá)氏鰉外，其它所有序列來(lái)源于Genbank。相同的氨基酸殘基用黑色陰影高亮顯示，60%一致的氨基酸殘基用灰色陰影表示

圖3 采用MEGA X軟件構(gòu)建的基于GDH氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree based on GDH amino acid sequences by MEGA X

圖4 達(dá)氏鰉gdh基因在不同組織中的表達(dá)Fig.4 The transcription distribution of gdh in different tissues of H. dauricus

圖5 兩種蛋白原料對(duì)肝臟gdh、hsp90及腸gdh、apN、pepT1基因表達(dá)的影響Fig.5 The transcription differences of gdh and hsp90 in the liver(A) and gdh, apN, and pepT1 in the intestine(B) by the two different protein ingredients diets每組選取4尾魚進(jìn)行分析，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，*代表差異顯著(P<0.05)

3 討論

本研究從達(dá)氏鰉中克隆得到谷氨酸脫氫酶基因的ORF序列，氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果表明GDH在脊椎動(dòng)物中較為保守，暗示其具有保守的生物學(xué)功能。谷氨酸是含量最高的游離氨基酸之一，廣泛分布于各種組織中，包括腦、骨骼肌、肝、腎、腸和脂肪等組織中。本研究也發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉gdh基因在所有組織中廣泛表達(dá)(圖4)，這與其對(duì)谷氨酸的分解代謝功能是相一致的。在凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)[12]、明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[13]及斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeusmonodon)[14]中，gdh在肌肉中大量表達(dá)，這可能與甲殼動(dòng)物的大量氨基酸代謝發(fā)生在肌肉中有關(guān)。在湘云鯽和紅鯽中，gdh在肝臟和前腸中表達(dá)量都較高[15]。本研究中達(dá)氏鰉gdh在腸中表達(dá)量最高，在肝臟組織中也有大量表達(dá)。腸道是魚類氨基酸消化、吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)的主要場(chǎng)所。另外，大量的研究證實(shí)GDH在肝臟和腸中的氨氮代謝中也發(fā)揮重要作用[12-14]。因此，GDH在肝臟和腸道中的高表達(dá)與其參與氨基酸消化及氨氮代謝功能相一致。

熱休克蛋白又稱為應(yīng)激蛋白, 包含HSP90、HSP70、HSP60等蛋白家族。它是生物細(xì)胞(包括原核細(xì)胞及真核細(xì)胞)在受熱、生物應(yīng)激、理化因素等應(yīng)激原刺激后, 發(fā)生熱休克反應(yīng)時(shí)所產(chǎn)生的一類伴隨細(xì)胞蛋白[16]。在本研究中，當(dāng)在飼料中添加雙低菜粕時(shí)，肝臟中hsp90的表達(dá)沒有發(fā)生變化(圖5A)，這說(shuō)明雙低菜粕的添加沒有引起達(dá)氏鰉魚體的應(yīng)激反應(yīng)。

在本團(tuán)隊(duì)前期研究中，達(dá)氏鰉對(duì)魚粉組總氨基酸的表觀消化率(98.62%±3.86%)顯著高于豆粕組(85.68%±3.97%)[10]。為了研究飼料中添加雙低菜粕是否會(huì)引起達(dá)氏鰉蛋白質(zhì)代謝水平的升高，分別檢測(cè)了與蛋白質(zhì)消化相關(guān)的gdh、apN基因及多肽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的pepT1基因的表達(dá)變化。GDH主要催化谷氨酸的去氨基化，生成副產(chǎn)品氨，參與氮代謝循環(huán)。APN屬于鋅金屬肽酶家族的一個(gè)成員，屬肽鏈端解，其在腸道中主要參與氨基酸的N端水解，以將小的多肽消化成氨基酸[17-18]。動(dòng)物腸道小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體pepT1的主要功能是將小肽從細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，在動(dòng)物吸收外源小肽中起關(guān)鍵作用[19]。本研究結(jié)果顯示，雙低菜粕組腸道中g(shù)dh和apN的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于基礎(chǔ)飼料組，pepT1的變化沒有顯著性差異(圖5B)。這說(shuō)明為了更好地消化植物性蛋白質(zhì)，達(dá)氏鰉體內(nèi)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄水平得到提高，但是小肽轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程變化不顯著。以上結(jié)果暗示，在達(dá)氏鰉飼料中添加雙低菜粕，需綜合考慮其對(duì)生長(zhǎng)及體內(nèi)蛋白代謝水平的影響。