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    中華鱉GnRH 1基因cDNA克隆及表達特征

    2019-07-26 06:58:16張英萍王利華王詠星鄒桂偉梁宏偉
    淡水漁業(yè) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:信號肽性腺雌性

    申 慧,張英萍,王利華,沙 航,王詠星,鄒桂偉,梁宏偉

    (1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,烏魯木齊 830046;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所,武漢 430223;3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海 201306)

    促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是由下丘腦分泌的,動物生殖過程中最重要的激素之一,在脊椎動物的性腺發(fā)育、繁殖功能維持中起著重要的作用。它是下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic-pituitary-gonadal,HPG)軸的關(guān)鍵信息分子;由下丘腦接收的信息以間歇性脈沖的形式來分泌GnRH,從而刺激垂體前葉分泌促性腺激素(Gonadotropin,GTH),即促卵泡素(follocle-stimulating hormone,FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone,LH),進而促進睪丸或卵巢的發(fā)育并分泌睪酮(testosterone,T)或雌二醇(estrogen,E2),從而調(diào)節(jié)性激素的分泌[1],調(diào)控性腺影響配子的發(fā)育與成熟[2-3]。脊椎動物中大多數(shù)物種至少存在兩種促性腺激素釋放激素,硬骨魚中一般存在3種類型的促性腺激素釋放激素。促性腺激素釋放激素來源和定位的不同,也造成了不同類型促性腺激素釋放激素在功能方面的差異。脊椎動物具有多個GnRH亞型,分為三個主要組分,即GnRH1、GnRH2和GnRH3[4]。一般認(rèn)為存在于下丘腦的組織特異性GnRH為GnRH1,即sbGnRH,主要作用是刺激促性腺激素的釋放。GnRH2在結(jié)構(gòu)上高度保守,包含由中腦神經(jīng)元表達的所有GnRH形式,主要調(diào)節(jié)性行為和攝食行為。GnRH3目前只在硬骨魚中被發(fā)現(xiàn),由位于腹側(cè)前腦的神經(jīng)元表達,且已被證明其發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)功能[5-6]。

    中華鱉(Pelodiscussinensis)作為我國重要的水產(chǎn)名優(yōu)經(jīng)濟動物,2016年全國的養(yǎng)殖產(chǎn)量約34.5萬噸,已成為我國漁業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化、農(nóng)民增收致富的重要養(yǎng)殖對象之一[7-8]。中華鱉養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時,由于養(yǎng)殖戶的盲目引種、不科學(xué)的配組繁殖,使得中華鱉生長速度減慢、群體整齊度降低和畸形率增加,嚴(yán)重制約其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。中華鱉屬于分批產(chǎn)卵的卵生爬行動物,相比較魚來說,產(chǎn)卵量少,繁殖效率較低,因此對其繁殖機理的研究不僅有利于改善其繁殖性能,也有利于中華鱉新品系(種)的培育。本試驗以中華鱉GnRH1基因為研究對象,對其在不同性別、不同組織和胚胎發(fā)育過程中的表達特征進行分析,為今后GnRH基因在中華鱉生殖調(diào)控等方面的研究提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    實驗所用中華鱉收集自安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,選取健康且活力好的1齡中華鱉雌雄個體各3只,其中雄性(395.36±20.55)g,雌性(283.72±18.02)g,活體經(jīng)麻醉后,解剖采集腦、心臟、肝臟、脾臟、肺、肌肉、腸、卵巢或精巢等8組織樣品;參照Tokita等[10]對中華鱉胚胎發(fā)育過程的分期,選取30 ℃孵化條件下中華鱉發(fā)育的第8期、第10期至第18期共10個時期的胚胎,每時期均取3個重復(fù)樣本;樣品于液氮罐中保存過夜后轉(zhuǎn)至-80 ℃保存。

    1.2 總RNA提取及cDNA的合成

    取保存的雄性中華鱉腦組織,根據(jù)Trizol試劑說明書提取總RNA,用核酸蛋白定量儀(Nanodrop 2000 Thermo Scientific,美國)檢測提取的RNA濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,大連)合成cDNA,同時使用SMARTerTMRACE 5′、3′ Kit(TaKaRa,大連)分別合成5′、3′ RACE cDNA模板,-20 ℃保存。

    1.3 中華鱉GnRH 1基因全長cDNA的克隆

    根據(jù)GenBank中華鱉GnRH1基因mRNA預(yù)測序列(XM_014569063.2),設(shè)計克隆GnRH1基因中間片段引物(表1)。PCR體系參考PCR Master Mix試劑說明書(20 μL),反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,35個循環(huán);72 ℃ 3 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。根據(jù)獲得的GnRH1基因中間序列設(shè)計用于5′ 和3′ RACE擴增的引物(表1)。3′ RACE采用引物GnRH1-3′ outer和試劑盒提供的接頭引物3′ adapter進行第一輪PCR擴增,接著以引物GnRH1-3′ inner和3′ adapter進行巢式PCR二輪擴增。5′ RACE采用引物GnRH1-5′ outer和試劑盒接頭引物5′ adapter以加尾的cDNA為模板進行第一輪PCR擴增,然后以GnRH1-5′ inner引物和5′ adapter進行巢式PCR第二輪擴增。PCR目的條帶純化回收后連接到pUC-19T載體,后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng),挑取陽性克隆送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

    1.4 中華鱉GnRH 1基因全長及序列分析

    將克隆得到的片段通過DNAMAN軟件進行拼接,并用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.n ih.gov/o-rffinder/)在線工具預(yù)測基因的開放閱讀框(ORF)位置;然后利用Expasy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)將其翻譯為氨基酸序列并預(yù)測蛋白的相對分子質(zhì)量和等電點;采用在線工具SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/Sign-alP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分別對其信號肽以及跨膜區(qū)進行預(yù)測;利用Net-Phos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測氨基酸功能位點;使用DNAMAN軟件對中華鱉GnRH1及其同源氨基酸序列進行比對;使用Prabi-Geland在線工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopm.html)預(yù)測氨基酸的二級結(jié)構(gòu);使用SWISS-MODEL在線工具(https://www.swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建蛋白三維模型。

    表1 中華鱉GnRH 1基因序列擴增引物信息

    1.5 中華鱉GnRH 1系統(tǒng)發(fā)育分析

    從GenBank下載墨西哥箱龜(Terrapenemexicanatriunguis,XP_024067919.1)、西部頸龜(Chrysemyspictabellii,XP_005285222.1)、綠海龜(Cheloniamydas,EMP30498.1)、美國短吻鱷(Alligatormississippiensis,KYO44455.1)、揚子鱷(A.sinensis,XP_014377775.1)、原雞(Gallusgallus,NP_001074346.1)、綠頭鴨(Anasplatyrhynchos,XP_012959602.1)、卡氏小鼠(Muscaroli,XP_021038275.1)、人(Homosapiens,NP_000816.4)、牛(Bostaurus,NP_001071605.1)、馬(Equuscaballus,XP_003364546.3)、非洲象(Loxodontaafricana,XP_023406765.1)、白鯨(Delphinapterusleucas,XP_022450743.1)、帝王鮭(Oncorhynchustshawytscha,XP_024296453.1)、銀大馬哈魚(Oncorhynchuskisutch,XP_020344148.1)、斑馬擬麗魚(Maylandiazebra,XP_004544170.1)、大黃魚(Larimichthyscrocea,KKF17334.1)、青鳉(Oryziaslatipes,NP001098169.1)、黃鱔(Monopterusalbus,XP_020446236.1)等20種物種的GnRH1氨基酸序列,利用MEGA 7.0軟件經(jīng)Clustalw序列比對后,以鄰接法(Neighbor-Joining)1 000次bootstraps,構(gòu)建基于GnRH1氨基酸序列的分子系統(tǒng)進化樹。

    1.6 GnRH 1基因mRNA在中華鱉不同組織及不同發(fā)育時期的表達特征

    以雌雄個體不同組織和不同發(fā)育時期胚胎的cDNA作為熒光定量PCR(qRT-PCR)模板,依據(jù)中華鱉GnRH1基因設(shè)計qRT-PCR引物,18s rRNA內(nèi)參基因引物采用已發(fā)表序列[11](表1)。利用ABI 7500熒光定量PCR儀檢測GnRH1 mRNA相對表達情況,每個樣品重復(fù)3次。PCR反應(yīng)體系為20 μL:2×SYBR Premix ExTaq 10 μL,10 μmol/L 上下游引物各 0.4 μL,ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL,cDNA 2 μL,超純水 6.8 μL;擴增程序為;95 ℃預(yù)變性 30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火34 s,共40個循環(huán);95 ℃ 15 s,60 ℃退火 60 s,95 ℃ 15 s。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進行分析,數(shù)據(jù)分析利用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析,差異顯著性以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

    2 結(jié)果

    2.1 中華鱉GnRH 1基因的克隆及序列特征

    克隆獲得的中華鱉GnRH1基因全長cDNA共為546 bp,5′ UTR區(qū)99 bp,3′ UTR區(qū)168 bp,編碼區(qū)279 bp,含有1個加尾信號序列AATAAA(491 bp處)及PolyA(30 bp)尾,共編碼92個氨基酸;具有N端信號肽(1~23 aa)、核心十肽區(qū)域(24~33 aa)和相關(guān)肽區(qū)域(37~92 aa),以及斷裂位點GKR(34~36 aa),符合GnRH蛋白典型結(jié)構(gòu)特征(圖1)。

    圖1 中華鱉GnRH 1 cDNA 序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 GnRH 1 cDNA sequence and putative amino acid of P.sinensis

    2.2 中華鱉GnRH 1氨基酸序列

    采用MEGA 7軟件構(gòu)建基于中華鱉GnRH1和其他20個物種氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹(圖2)。結(jié)果表明,中華鱉首先與龜鱉目的墨西哥箱龜、西部頸龜、綠海龜聚為一支,然后與爬行綱的美國短吻鱷、揚子鱷再聚為一支,最后與鳥綱中的原雞和綠頭鴨聚在一起,5種哺乳綱物種和6個硬骨魚綱物種均單獨聚為一支。

    圖2 基于GnRH 1氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree for different species based on GnRH 1 AA sequences“☆”表示中華鱉

    2.3 中華鱉GnRH 1基因的生物信息學(xué)

    中華鱉GnRH1 cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。起始密碼子和終止密碼子用灰色陰影部分標(biāo)出,GnRH1信號肽用單下劃線表示,斷裂位點 GKR 用雙下劃線表示,GnRH1核心十肽置于方框內(nèi),GnRH1相關(guān)肽(GAP)用虛下劃線表示,*表示終止密碼子,波浪線代表3′非翻譯區(qū)加尾信號AATAAA(圖3)。

    中華鱉GnRH1基因編碼的蛋白質(zhì)理論分子質(zhì)量為10.23 kDa,分子式為C454H725N121O135S6,理論等電點pI為5.65,不穩(wěn)定指數(shù)為53.10,脂溶指數(shù)為86.96,總平均疏水指數(shù)為-0.172,為親水性蛋白。信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示,該蛋白信號肽切割位點位于第23和24個氨基酸殘基之間,N-端具有一個由23個氨基酸組成的信號肽以及一個跨膜區(qū)(7~29 aa),為分泌蛋白;磷酸化位點有5個Ser,1個Thr,1個Tyr;無N糖基化位點。該蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占68.48%,隨機卷曲占20.65%,β-轉(zhuǎn)角占6.52%。基于同源氨基酸構(gòu)建的中華鱉GnRH1氨基酸三維模型(圖4),顯示該蛋白為單鏈蛋白。

    圖3 GnRH 1氨基酸序列比對Fig.3 Multiple sequences alignment of GnRH 1 amino acidsquences from different species黑色標(biāo)注保守氨基酸,紅色標(biāo)注相似性大于75%的氨基酸,藍(lán)色標(biāo)注相似性大于50%的氨基酸

    圖4 中華鱉GnRH 1蛋白三級結(jié)構(gòu)模式圖Fig.4 Tertiary structure pattern of GnRH 1 protein in P.sinensis

    2.4 中華鱉GnRH 1基因表達特征

    通過qRT-PCR對中華鱉GnRH1基因在雌雄不同種組織中的表達特異性進行分析,結(jié)果表明(圖5),GnRH1基因在所檢測的8組織中均有表達,但表達量存在較大差異。雌性和雄性個體中GnRH1基因均在腦中表達量最高,在心臟中表達量最低,幾乎不表達,在腸和脾臟組織中略有表達。在雌雄個體之間,在雄性腦和性腺中的表達量顯著高于雌性(P<0.05)。中華鱉GnRH1基因在第8期、第10期至第18期10個發(fā)育時期胚胎中的表達情況如圖6所示,GnRH1基因在第8期到第11期表達量很低,第12期開始表達量顯著增高,并維持到第14期,第15期又出現(xiàn)顯著增高,第16期表達量最高,然后呈下降趨勢。

    圖5 中華鱉GnRH 1基因在成體組織的表達分析Fig.5 The expression of GnRH 1 in adult tissues of P.sinensis1:心臟;2:肝臟;3:腸;4:腦;5:肌肉; 6:性腺;7:肺;8:脾臟;*表示差異顯著(P<0.05);**表示差異極顯著(P<0.01)

    圖6 中華鱉GnRH 1基因在胚胎各時期的表達Fig.6 The expression of GnRH 1 in different stages of embryo不同字母表示差異顯著(P<0.05)

    3 討論與結(jié)論

    本研究克隆獲得的中華鱉GnRH1基因包括99 bp 5′端非編碼區(qū),279 bp完整編碼區(qū)和168 bp 3′端非編碼區(qū),共編碼92個氨基酸,核心十肽為QHWSYGLQPG。GnRH1基因編碼蛋白含有一個由23氨基酸構(gòu)成的信號肽,為分泌蛋白和親水性蛋白,預(yù)測三維結(jié)構(gòu)為單鏈蛋白,符合GnRH蛋白的典型特征,這與京海黃雞GnRH1蛋白性質(zhì)的研究具有相似的結(jié)果[12]。不同物種間GnRH1氨基酸序列具有較高的保守性,中華鱉與綠海龜?shù)南嗨菩宰罡邽?1%,與同為爬行綱的墨西哥箱龜、西部頸龜、美國短吻鱷和揚子鱷同源性分別89%、88%、75%和75%。系統(tǒng)發(fā)育表明,所分析的物種分為爬行類、鳥類、哺乳類及魚類,與其分類地位一致,中華鱉與同為龜鱉目的綠海龜親緣關(guān)系最近。研究表明GnRH1的信號肽和核心十肽部分非常保守,但在不同物種間,GAPs同源性很低[14]。GnRH1是促進性激素分泌的激素的主要形式,在不同物種中的特異性比較高,對個體性腺發(fā)育和配子生成有重要作用[9,13]。

    在牙鲆、圓斑星鰈、美洲鰣魚和許氏平鮋等眾多物種中GnRH1基因的表達特征呈現(xiàn)出表達的普遍性,但在一些不同的物種中也存在差異[14-17]。美洲鰣魚中GnRH1的表達呈現(xiàn)出性別二態(tài)性,雌性美洲鰣魚腦組織中GnRH1的表達水平顯著高于雄性,從生長上來看,雌性個體往往比雄性個體大,呈現(xiàn)出生長差異。Swapna等研究了GnRH1基因在羅非魚雌雄間性的差異性表達發(fā)現(xiàn),雄性羅非魚GnRH分泌神經(jīng)元比雌性提前出現(xiàn)10 d,數(shù)量上也高于雌性;雄性羅非魚的生長速度快于雌性,且體型往往比雌性大,分泌時間與分泌水平表現(xiàn)出的差異,可能與性別的分化以及生長的速度有關(guān)[18]。在魚類中,GnRH類似物可促進垂體中生長激素(Growth hormone,GH)的分泌與合成,提高魚類的生長速率,給鯉、草魚、羅非魚和黑鯛等注射GnRH類似物可以提高其血清中的GH水平從而提高其生長速率[19-21]。本研究中中華鱉GnRH1表達呈現(xiàn)性別差異性,且在雄性個體的腦和性腺組織中的表達高于雌性,從二者的生長情況上來看,雄性個體往往比雌性大,呈現(xiàn)出生長上的差異,這與在美洲鰣魚及羅非魚中的研究類似[16,18]。

    基于Tokita等[10]對中華鱉胚胎發(fā)育的分期,30 ℃孵化的第15 天處于胚胎發(fā)育處于第14期和第15期之間。本研究中中華鱉GnRH1在胚胎發(fā)育第15期表達量急劇上升,與李慧君[22]認(rèn)為在第15天原始性腺形成的觀點一致,表明該基因的表達與胚胎性腺發(fā)育有著密切關(guān)系。在美洲鰣魚、大菱鲆、條紋鱸[16,23-25]等的研究中也發(fā)現(xiàn)GnRH1的表達與性腺發(fā)育存在周期間一致性變化,推測該基因在中華鱉中與性腺發(fā)育同樣密切相關(guān),后續(xù)將進行相關(guān)研究驗證。

    本研究克隆獲得了中華鱉GnRH1基因序列,其編碼蛋白含有一個由23氨基酸構(gòu)成的信號肽,為分泌蛋白和親水性蛋白;并獲得了GnRH1基因在中華鱉不同組織及不同發(fā)育時期胚胎中的表達特征,為深入了解中華鱉生長繁殖的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。但是由于僅研究了1齡雌雄中華鱉不同組織中的表達差異,后續(xù)還需要對中華鱉GnRH1基因在不同發(fā)育階段組織中的表達特征進行進一步的研究,以期獲得與雌雄生長差異之間的關(guān)系。

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