高效液相色譜和超高效液相色譜法測定乳制品中三聚氰胺含量的對比

1 引言

三聚氰胺(英文名Melamine)，簡稱三胺，又名蜜胺、氰尿酰胺。分子式C3N3H6,分子量126.12。白色結(jié)晶粉末，無味，相對密度1570kg/m3。微溶于水（3.1g/L常溫），可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等，不溶于丙酮、醚類、對身體有害，不可用于食品加工或食品添加物。[1,2]

但由于目前食品檢測中測定蛋白質(zhì)的凱氏定氮法是通過測定樣品中氮原子含量來間接推算出蛋白質(zhì)含量的，而此方法無法識別氮的來源，蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，而是三聚氰胺含氮量高達(dá)66.67%，少量添加即可大大提高產(chǎn)品的含氮量，不法商人借此提升食品檢測蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，從而通過檢驗機(jī)構(gòu)的檢測[3]。

而對于三聚氰胺的測定方法有很多，例如液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）等，其中毛細(xì)管電泳法和分光光度法靈敏度低，只可滿足一般檢測要求；氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生化步驟，操作繁瑣；ELISA則只適用于大批樣快速篩選檢測，若為陽性需進(jìn)一步確證[4]。而液相色譜法為國標(biāo)中乳與乳制品檢測的推薦方法，可定性定量[5]，但普通液相色譜法仍有測定樣品周期長，產(chǎn)生廢液量大的缺點(diǎn)，故本文對原有HPLC方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化并優(yōu)化，建立超高效液相色譜（UPLC）法，為乳制品中三聚氰胺含量的測定提供更快速、高效、靈敏和環(huán)保的方法。

2 材料

2.1 儀器

島津LC_20AB型高效液相色譜儀（日本 島津）；Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀(美國 沃特世)；AG285 型天平(瑞士 梅特勒)；超純水儀(美國 密理博）。

2.2 試劑

三聚氰胺對照品（CAS 108-78-01,純度大于99.0%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、辛烷磺酸鈉（色譜純）、超純水。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

3.1.1 HPLC色譜條件：色譜柱為 Agilent Zorbax SB_C18柱（250mm×4.6mm,5μm）;以離子對試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動相，V:V=95:5；流速1.0mL/min；柱溫40℃；波長240nm；進(jìn)樣量10μL

3.1.2 UPLC色譜條件：色譜柱為 Acquity UPLC BEH C18柱（2.1mm×100mm,1.7μm）;以離子對試劑緩沖溶液（2.10g檸檬酸+2.16g辛烷磺酸鈉定容1L,pH為3.0）與乙腈為流動相，V:V=95:5；流速0.5mL/min；柱溫40℃；波長240nm；進(jìn)樣量0.5μL。

3.2 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取100mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶，用甲醇水溶液（1:1）溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4℃避光保存。用流動相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到濃度為0.2、2.0、10.0、20.0、30.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，過微孔濾膜后備用。在HPLC條件下三聚氰胺的保留時間為15.12min,在UPLC條件下保留時間為1.12min，見下圖。

3.3 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取2g試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL1%三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲并振蕩后，以4000r/min離心10min，上清液過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL濾液，加入5mL水混勻后轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次以3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干，用6mL氨化甲醇（5%）溶液洗脫。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物?mL流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜備用。

圖1 A HPLC三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 B UPLC三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品）

3.4 方法學(xué)考察

3.4.1 線性關(guān)系考察

HPLC方法：按“3.1.1”項下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣10.0μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=1.69×105+3.07×105 ,r2=0.9989,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

UPLC方法：按“3.1.2”項下色譜條件，濃度由低到高依次進(jìn)樣0.5μL，以峰面積（Y）-濃度（X）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=1.84×103+1.35×103,r2= 0.9999,三聚氰胺在0.2～30μg/mL內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.4.2 精密度試驗

HPLC方法：取“3.2”項下對照品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時間的RSD為15.21min，峰面積的RSD為0.20%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

UPLC方法：取“3.2”項下對照品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，連續(xù)進(jìn)樣6次，得三聚氰胺保留時間的RSD為1.12min，峰面積的RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.4.3 重復(fù)性試驗

取濃度為20.0μg/mL的標(biāo)液，照“3.3”項下的方法制備供試品溶測定三聚氰胺的含量，HPLC和UPLC的RSD分別 0.58%、0.44%。結(jié)果表明重復(fù)性良好。

3.4.4 穩(wěn)定性試驗

HPLC方法：取“3.3”項下供試品溶液，以10.0μL進(jìn)樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入HPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.66%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

UPLC方法：取“3.3”項下供試品溶液，以0.5μL進(jìn)樣量，分別于0,2,4,8,10，12,24h注入UPLC，得三聚氰胺峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明樣品中三聚氰胺在24h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.5 加標(biāo)回收試驗

取已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液做加標(biāo)回收試驗，取六個平行樣，分別加入定量三聚氰胺對照品，按“3.2”項下方法制備供試品溶液，測定回收率，結(jié)果見表1。

3.4.6 樣品含量的測定

取不同品牌不同批次的乳制品20批，分別按“3.3”項下方法進(jìn)行處理，并分別按照HPLC和UPLC色譜檢測條件，測定其中三聚氰胺的含量，用外標(biāo)法計算。結(jié)果表明HPLC和UPLC均未檢出三聚氰胺，見圖2。

圖2 C HPLC三聚氰胺樣品 D UPLC三聚氰胺樣品

4 討論

本實(shí)驗通過對比HPLC和UPLC法對乳制品中三聚氰胺含量的測定結(jié)果表明，兩種方法的精密度、準(zhǔn)確性等方面的差異不大，但在靈敏度方面UPLC明顯高于HPLC,并且UPLC還具有分析時間短，流動相消耗量低的優(yōu)點(diǎn)，而在對乳制品的實(shí)際檢驗中，UPLC更能顯現(xiàn)出環(huán)保、高效的優(yōu)點(diǎn)，可以在對市面流通乳制品質(zhì)量的控制中得到廣泛應(yīng)用。

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