新抑癌基因GPD1在結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8中的作用及其預(yù)后潛力研究

閔 力 李恒存 郭慶東 王星宇 張澍田

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化分中心 國(guó)家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 消化疾病癌前病變北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京消化中心，北京 100050)

在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌發(fā)病率排名第三，病死率排名第四，其中70%都是結(jié)腸癌[1]。近年來，我國(guó)的結(jié)腸癌發(fā)病率顯著上升，可能與人民生活方式及飲食習(xí)慣的改變有關(guān)[2]。結(jié)腸癌的發(fā)病原因復(fù)雜，在分子水平上進(jìn)行機(jī)制研究，尤其是探索新的分子標(biāo)志物與治療靶點(diǎn)，對(duì)于促進(jìn)結(jié)腸癌診療，提高患者的預(yù)后具有重要意義[3-4]。

甘油-3-磷酸脫氫酶1(Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase 1，GPD1)基因位于染色體12q13.12上，是胞質(zhì)蛋白GPD1的編碼基因。GPD1催化磷酸二羥丙酮(dishychoxyactone phosphate, DHAP)與甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate,G3P)/NAD+之間的可逆氧化還原反應(yīng)，且GPD1與線粒體亞型GPD2一起發(fā)揮將還原當(dāng)量從胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體的作用[5]。GPD1被認(rèn)為是連接碳水化合物和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因素，其活性異?？纱龠M(jìn)肥胖患者中三?；视?triacylglycerol,TAG)合成的增加或減少[6]，在高三酰甘油血癥、脂肪肝、肝纖維化、肝腫大和脂肪性肝炎中起著至關(guān)重要的作用[7]。Basel-Vanagaite等[8]報(bào)道了攜帶GPD1純合子剪接突變(c.361-1G>C)的10名患者，表現(xiàn)為早發(fā)性肝腫大，肝臟脂肪變性和高三酰甘油血癥，是第一個(gè)確定GPD1基因與人類疾病相關(guān)的研究。然而，GPD1與腫瘤發(fā)展的關(guān)系研究較少。Zhou等[9]首先報(bào)道，GPD1在乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)，且GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑制腫瘤增生/遷移和侵襲的作用。在結(jié)腸癌中，GPD1的表達(dá)情況與功能目前尚無相關(guān)研究。

在本研究中，筆者主要探索了GPD1在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8中的作用，同時(shí)明確了GPD1表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系，并結(jié)合生物信息學(xué)分析揭示了GPD1在結(jié)腸癌中低表達(dá)可能與其編碼基因高甲基化相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

胎牛血清(fetal calf serum， FBS)、Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco公司，美國(guó))、MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-ly)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]細(xì)胞增生試劑盒(Amresco公司，美國(guó))；Lipofectamin 3000(Invitrogen公司，美國(guó))；GPD1抗體(sc-376219, Santa Cruz公司, 美國(guó))；恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(三洋公司，日本)；25 cm2Costar無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司，美國(guó))；多功能酶標(biāo)儀(MD公司，美國(guó))；超純水機(jī)(Millipore公司，美國(guó))；GPD1 siRNA(吉瑪公司，中國(guó))

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HCT-8人結(jié)腸癌細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在添加有10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃和5%(體積分?jǐn)?shù))CO2。應(yīng)用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行si-GPD1的轉(zhuǎn)染，以Western blotting驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。GPD1 siRNA購(gòu)自蘇州吉瑪有限公司。si-GPD1-1的序列為5′-CACUGGCAUAUCUCUUAUU-3′，si-GPD1-2序列為5′-GCAGCAUGAGAAUGUCAAA-3′。NC siRNA序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。GPD1的qPCR檢測(cè)引物為5′-CCAGGGACAACTCCTGAAAGA-3′(正向)與5′-TTGGCGAAGGCTATCATCTCC-3′(反向)。GAPDH的qPCR檢測(cè)引物為5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′(正向)與5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′(反向)。

1.3 MTS實(shí)驗(yàn)

將HCT-8細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，在96孔板的每個(gè)孔中接種1 000個(gè)細(xì)胞，共接種4板細(xì)胞。在0、24、48和72 h的時(shí)間點(diǎn)分別取出1板細(xì)胞并將MTS試劑加入孔中。在37 ℃下孵育2 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染處理后的HCT-8細(xì)胞消化后重懸并計(jì)數(shù)后，以1 000每孔的細(xì)胞濃度在6孔板中進(jìn)行細(xì)胞接種，分為對(duì)照組(Normal control, NC)與GPD1干擾組，每組各設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞充分混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d換液1次，培養(yǎng)至肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后以5×105的細(xì)胞濃度均勻接種在6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合。使用無菌移液管尖端在每個(gè)孔中進(jìn)行劃痕處理。用無菌PBS進(jìn)行洗滌以清除細(xì)胞碎片，然后在不含F(xiàn)BS的純培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在36 h的時(shí)間點(diǎn)，在每孔的相同位置拍攝記錄遷移狀態(tài)。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以2×105的細(xì)胞濃度均勻接種在24孔板中，遷移實(shí)驗(yàn)用Chamber為普通Chamber，侵襲實(shí)驗(yàn)用Chamber為特制的Matrigel Invasion Chamber，在下室加入800 μL 含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的培養(yǎng)基，上室加入150 μL細(xì)胞懸液(無血清)，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24 h，用鑷子小心取出Chamber，吸干上室液體，移到預(yù)先加入約800 μL甲醇的孔中，室溫固定30 min后DAPI染色，觀察計(jì)數(shù)。

1.7 生物信息分析

筆者從TCGA官方網(wǎng)站上下載了結(jié)直腸癌患者Level 3的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以及甲基化芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)GPD1的表達(dá)中位數(shù)將患者分為GPD1高表達(dá)與低表達(dá)兩組，從而比較這兩組的生存差異及對(duì)應(yīng)的GPD1甲基化水平差異，同時(shí)對(duì)全部病例GPD1的mRNA表達(dá)水平及其甲基化水平進(jìn)行了相關(guān)性分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Western blotting驗(yàn)證si-GPD1的基因敲低效率

多種結(jié)腸癌細(xì)胞系及正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系中GPD1的表達(dá)結(jié)果顯示，不同細(xì)胞系之間GPD1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中HCT-8細(xì)胞系中GPD1表達(dá)水平最高(圖1A)。為驗(yàn)證si-GPD1的基因敲低效率，筆者以NC組及si-GPD1-1/si-GPD1-2轉(zhuǎn)染48 h后的HCT-8細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染處理后，與對(duì)照組相比，si-GPD1處理組GPD1蛋白表達(dá)量均明顯下降，證明si-GPD1效果可靠，為后續(xù)功能學(xué)實(shí)驗(yàn)提供了保障(圖1B)。

圖1 GPD1在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8中的功能Fig.1 Functions of GPD1 in colon cancer cell HCT-8

A:GPD1 expression level in different colon cancer and noncancerous cell lines (reference cell: CCC-HIE-2，n=3);B: After si-GPD1-1/si-GPD1-2 treatment, GPD1 expression level in HCT-8 significantly decreased;CandD: After siRNA knock down ofGPD1, growth rate of HCT-8 was upregulated (n=3);E: After siRNA knock down ofGPD1, colony formation ability of HCT-8 was upregulated (n=3).**P<0.01,***P<0.001;GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.2 GPD1干擾后結(jié)腸癌細(xì)胞增生、集落形成能力增強(qiáng)

MTS實(shí)驗(yàn)與集落形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在GPD1基因敲低后，HCT-8細(xì)胞增生活力增強(qiáng)，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(全部時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析P<0.001，72 h時(shí)間點(diǎn)t檢驗(yàn)P<0.01)(圖1C，D)；在集落形成實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，GPD1基因干擾組集落形成數(shù)量增多，且集落直徑較大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1E)。

2.3 GPD1干擾后HCT-8細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)能力無明顯變化

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在干擾GPD1基因表達(dá)后，HCT-8細(xì)胞的遷移能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A)；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果也顯示，GPD1敲低后HCT-8的遷移及侵襲能力均沒有顯著性變化(圖2B、C)。

圖2 GPD1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-8運(yùn)動(dòng)能力的影響Fig.2 Influence of GPD1 on motility of HCT-8 cells

A:After siRNA knock down ofGPD1, scratch healing ability of HCT-8 was unchanged (n=3);B: After siRNA knock down ofGPD1, transwell migration ability of HCT-8 was unchanged (n=3);C: After siRNA knock down ofGPD1, transwell invasion ability of HCT-8 was unchanged (n=3).GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;NC:Normal control.

2.4 GPD1低表達(dá)是結(jié)直腸癌預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素

應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，GPD1低表達(dá)的結(jié)直腸癌患者總存活率(χ2=4.1,P=0.040)及無病存活率(χ2=13.2,P<0.000 1)均明顯低于GPD1高表達(dá)患者(圖3A，B)。進(jìn)一步納入患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期等臨床因素，進(jìn)行多因素COX模型分析結(jié)果顯示，腫瘤的T分期、M分期，以及GPD1表達(dá)水平都是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(Wald testχ2=44.0,P<0.001，表1)。

表1 GPD1表達(dá)水平是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素Tab.1 GPD1 expression level is an independent predictor of prognosis of CRC patients

GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1;DFS: disease free survival;HR: hazard ratio;CI: confidence interval；CRC：colorectal cancer.

2.5 結(jié)直腸癌中GPD1的低表達(dá)可能與其編碼基因的高甲基化相關(guān)

為探究結(jié)直腸癌組織中GPD1低表達(dá)是否與DNA甲基化相關(guān)，筆者以TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示，GPD1甲基化水平高的腫瘤中GPD1的表達(dá)水平顯著較低(圖3C)，Pearson相關(guān)性分析顯示，GPD1的表達(dá)水平與其甲基化水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.253，P<0.001)(圖3D)。

圖3 GPD1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者預(yù)后相關(guān)，結(jié)直腸癌中GPD1低表達(dá)與編碼基因高甲基化相關(guān)Fig.3 GPD1 expression level is associated with prognosis of CRC patients, which is also negatively correlated with GPD1 gene methylation level

A: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter overall survival;B: Patients with a lowerGPD1 showed a shorter disease free survival;C: DifferentGPD1 expression level in differentGPD1 methylation status;D: mRNA level ofGPD1 was negatively correlated withGPD1 gene methylation level;CRC:colorectal cancer；GPD1:glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1.

3 討論

GPD1在機(jī)體代謝反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，前期研究[10]報(bào)道GPD1催化葡萄糖來源的DHAP與甘油-3-磷酸(glycerol-3-phosphate，G3P)之間的轉(zhuǎn)化，后者參與生成三酰甘油，而GPD1基因突變被報(bào)道與多種代謝性疾病相關(guān)[7]。Zhou等[9]報(bào)道GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用，且與乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)。然而，GPD1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能研究仍為空白。

在本研究中，筆者應(yīng)用HCT-8結(jié)腸癌細(xì)胞系敲低GPD1基因表達(dá)進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，干擾GPD1后，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8的增生活力與集落形成能力顯著提高，與GPD1在乳腺癌中的作用相一致[9]，而細(xì)胞遷移能力無顯著變化。此外，在本研究中筆者首先明確了GPD1表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后的關(guān)系。通過對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析，筆者發(fā)現(xiàn)GPD1低表達(dá)結(jié)直腸癌患者的總存活率及無病存活率更低，且GPD1低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，這與筆者細(xì)胞功能學(xué)研究的結(jié)果是相一致的，均證明GPD1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。有研究[11]顯示DNA甲基化在不可逆啟動(dòng)子沉默/調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用。在GPD1的表達(dá)調(diào)控方面，筆者首次探索了GPD1在結(jié)直腸癌中低表達(dá)與其編碼基因甲基化之間的關(guān)系，數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，GPD1低表達(dá)可能是由其編碼基因高甲基化引起的。

有文獻(xiàn)[12]報(bào)道GPD1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用，且其抑癌作用與細(xì)胞增生有關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。惡性腫瘤因其不受控制的細(xì)胞增生需要大量的能量支持[13]。而癌細(xì)胞表現(xiàn)出相對(duì)于正常分化細(xì)胞不同的細(xì)胞代謝方式[14]，過去十年的進(jìn)展表明，腫瘤代謝改變的幾個(gè)特征是由各種致癌基因或腫瘤抑制因子的變化誘導(dǎo)的[15-17]。GPD1編碼蛋白甘油-3-磷酸脫氫酶1參與碳水化合物與脂質(zhì)之間的代謝轉(zhuǎn)化，Basel-Vanagaite等[8]報(bào)道了攜帶GPD1純合子剪接突變導(dǎo)致高三酰甘油血癥，而高三酰甘油血癥是結(jié)直腸癌的高危因素[18]。因此，筆者認(rèn)為，GPD1蛋白缺失很可能通過干擾碳水化合物與脂質(zhì)之間的正常代謝而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究來明確。

綜上所述，GPD1在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑制細(xì)胞增生與集落形成的作用，且GPD1低表達(dá)是結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。對(duì)GPD1的研究對(duì)發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)具有重大的臨床意義，但其具體作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步探索。