子宮內(nèi)膜異位癥原代細胞培養(yǎng)及纖維化相關(guān)蛋白檢測

張艷芹 吳 迪 鄧夢琪 常翔宇 苗勁蔚

(首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京 100006)

子宮內(nèi)膜異位癥 (endometriosis，EMs)是指子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)異位到宮腔以外的部分，以卵巢、子宮直腸陷凹、子宮骶韌帶等部位最常見，是生育期女性常見病、多發(fā)病，發(fā)病率高達7%～10%[1]。EMs患者中更是高達50%伴有不孕或盆腔疼痛[2]。EMs患者的異位病灶與正常在位子宮內(nèi)膜相似有明顯的激素依賴性，就EMs發(fā)病的侵蝕性、復(fù)發(fā)性和激素依賴性特征又與惡性腫瘤的生長有很大的相似性。目前關(guān)于EMs發(fā)病有經(jīng)血逆流、 體腔上皮化生等多種學說，其中以經(jīng)血逆流學說最被接受[3]。然而研究[4]證明90%的育齡期女性都存在經(jīng)血逆流現(xiàn)象，只有10%～15%的女性發(fā)病?？梢娊?jīng)血逆流可能是EMs發(fā)病的重要誘因，但不是發(fā)病的決定因素。EMs不僅發(fā)病率高，而且治療棘手，手術(shù)治療后5年復(fù)發(fā)率高達50%[5]。更為嚴重的是近年來EMs纖維化患者特定類型卵巢癌的發(fā)病率較正常育齡期女性有明顯的上升，目前研究[6]顯示EMs的基本病變?yōu)楫愇坏淖訉m內(nèi)膜組織在雌激素的作用下周期性剝脫，出血并被其周圍組織包裹繼而發(fā)生纖維化，形成異位結(jié)節(jié)最終形成盆腔粘連，因而導(dǎo)致慢性盆腔疼痛、不孕、月經(jīng)異常等一系列癥狀。為探索EMs發(fā)病的基礎(chǔ)以及EMs纖維化與盆腔疼痛及不孕的關(guān)系，針對EMs發(fā)病及進展的基礎(chǔ)醫(yī)學研究成為EMs研究的重點。目前關(guān)于EMs纖維化的研究有建立永生化細胞系和內(nèi)膜異位細胞原代培養(yǎng)兩種方法。但無論是通過癌細胞誘導(dǎo)還是基因水平改變建立EMs纖維化細胞系，其代表性都遠低于EMs細胞原代培養(yǎng)。因此本實驗采用改進的EMs原代細胞分離方法，分離出EMs間質(zhì)細胞。并使用分子生物學方法檢測原代細胞纖維化相關(guān)蛋白的表達水平。探究EMs 異位子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞與EMs在位及正常在位子宮內(nèi)膜間質(zhì)纖維化相關(guān)蛋白表達的差異。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集2017年9月-2018年9月于首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院行手術(shù)治療的EMs患者共12例及非子宮腺肌癥子宮肌瘤患者9例?；颊吣挲g22～48歲。所有患者術(shù)前未接受過激素類藥物治療，無其他女性生殖系統(tǒng)相關(guān)內(nèi)分泌、代謝、免疫疾病。無惡性腫瘤病史。入院時心、肺、肝、腎等功能檢查無明顯異常。該研究經(jīng)過首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會批準，倫理審批號：2018-KY-002-01。入選患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器

CO2細胞培養(yǎng)箱 (美國 Thermo Fisher Scientific公司) 、超凈細胞工作臺 ( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、微量可調(diào)移液槍(法國Glison公司) 、Eclipse TS100-F倒置光學顯微鏡 ( 日本 Nikon 公司) 、MULTIFUGE X3R 臺式離心機(美國 Thermo Fisher Scientific公司) 和Precision GP 10 型水浴鍋( 美國 Thermo Fisher Scientific公司)、不銹鋼細胞篩直徑74 μm，200目/150 μm，100目(南京公路牌)、免疫熒光顯微鏡(日本 Nikon公司)。

1.3 主要試劑

1∶1 DMEMs-F12培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，標準胎牛血清(美國Life公司)、1×PBS溶液(北京索萊寶公司)、 Ⅳ型膠原酶(美國Sigma公司)；0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶-EDTA溶液(北京索萊寶公司)、鼠抗人波形蛋白(美國CST公司，D21H3)、兔抗CTGF抗體(美國CST公司，D8Z8U)、兔抗COL1A1抗體(美國CST公司，#84336)及兔抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗體(美國CST公司,D4K9N)、青鏈霉素(北京索萊寶公司)。

1.4 原代細胞分離培養(yǎng)

在嚴格無菌條件下，取新鮮EMs在位、異位及正常人子宮內(nèi)膜組織，立即放入冰盒運輸至實驗室(從組織離體至細胞分離在2 h之內(nèi)完整)。根據(jù)文獻[7-8]所提供的EMs原代細胞培養(yǎng)方法進行不斷實踐及改進，通過新的實驗方案對EMs子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞進行原代分離。具體分離操作：(1)在超凈工作臺內(nèi)使用PBS將新鮮組織沖洗3次，清洗掉組織上的血液及巧克力囊液。(2)將組織分為兩份，一份用組織標本固定液保存，用免疫組織化學法檢測，另一部分放入6 cm細胞培養(yǎng)皿，用眼科剪剪成0.5～1.0 mm碎塊，肉眼觀呈糊狀。(3)加入3倍體積已經(jīng)預(yù)加溫至37 ℃的0.25%(質(zhì)量分數(shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液，混勻置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中消化5～10 min，消化過程中不斷吹打混勻。(4)消化后置于150 μm，100目細胞濾過網(wǎng)過濾。(5)將濾過液加入2倍體積的含10%(體積分數(shù))FBS及1%(體積分數(shù))1× PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細胞培養(yǎng)基終止消化。(6)過濾后的上層組織回收至6 cm細胞培養(yǎng)皿再次加入3倍體積的預(yù)加溫至37 ℃的0.25%(質(zhì)量分數(shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶EDTA混合溶液繼續(xù)消化10～15 min。同樣重復(fù)上述步驟，將消化結(jié)束后的液體通過150 μm，100目細胞濾過網(wǎng)，過濾液加入2倍體積含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)液終止消化。(7)將所有濾過液收集一起，通過74 μm，200目細胞濾過網(wǎng)。(8)將過濾后的細胞懸著液轉(zhuǎn)移入50 mL離心管中，700 r/min離心3 min，移除上清液(此處可保留1 mL離心后的細胞懸浮液，增加細胞回收數(shù)量)。(9)加入10%(體積分數(shù))FBS及1%(體積分數(shù))1×PS雙抗的1∶1 DMEMs-F12細胞培養(yǎng)基，吹打成均勻的細胞懸液。以細胞密度為1×105/mL，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(10)24 h即可觀察間質(zhì)細胞貼壁，48 h后換液，棄除未貼壁細胞，加入新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3 d換液一次。待細胞生長密度達80%～90%時即可用0.25%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶-EDTA消化傳代。傳代后細胞生長良好，6代內(nèi)細胞形態(tài)及生長速度無明顯變化。一般原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞8～10 d可長滿，傳代后細胞2～4 d即可長滿。

1.5 間質(zhì)細胞性質(zhì)鑒定

通過普通免疫組織化學方法及熒光免疫組織化學法檢測細胞爬片中波形蛋白(vimentin)的表達。(1)免疫組織化學法：將無菌的載玻片放入細胞培養(yǎng)皿中，制作細胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，山羊抗兔二抗1∶200濃度37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。(2)免疫熒光法：同樣是首先制作細胞爬片，使用波形蛋白(vimentin) 1∶100濃度4 ℃孵育過夜，后期使用647標記山羊抗兔IgG 1∶500濃度，37 ℃溫箱30 min，PBS沖洗3次，DAPI染核10 min，熒光顯微鏡拍照，熒光染色后操作均需避光。

1.6 組織水平檢測纖維化相關(guān)蛋白表達

對臨床獲取的EMs在位、異位以及正常人在位子宮內(nèi)膜，做組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達水平。具體方法：組織石蠟包埋切片，CTGF、α-SMA、Collagen α(1)一抗1∶100濃度4 ℃ 過夜，KPL山羊抗兔二抗1∶200 37 ℃溫箱30 min，DAB顯色劑顯色，光鏡下觀察。

使用蛋白免疫印跡法檢測細胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達，具體方法：將細胞收集進行蛋白提取BCA定量，制作等蛋白量點樣液跑膠，不封閉。5%(體積分數(shù))BSA-TBST稀釋一抗1∶1 000在4 ℃孵育過夜，5%(體積分數(shù))BSA-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG(H+L)HRP 1∶10 000，室溫孵育 40 min。洗膜顯影。

使用蛋白免疫印跡法檢測得到組織及細胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達條帶，圖片掃描后，使用軟件Gel Image ststem Ver. 4.00，對條帶灰度進行分析，得到以β-actin為基線的纖維化相關(guān)蛋白表達結(jié)果比值，進一步對組織及細胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達水平做對比。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 EMs原代細胞培養(yǎng)結(jié)果

共收集培養(yǎng)12份內(nèi)異癥異位及在位子宮內(nèi)膜組織，9份正常人子宮內(nèi)膜組織，EMs在位間質(zhì)細胞原代分離成功12例，成功率為100%。EMs異位組織分離培養(yǎng)12列成功11例，成功率為91.7%。正常人子宮內(nèi)膜組織分離9例成功8例，成功率為88.9%。EMs異位組織分離培養(yǎng)失敗的1例是因為操作時間過久引起細菌污染。正常人子宮內(nèi)膜組織分離培養(yǎng)失敗的1例是由于首次分離摸索條件時消化過度，細胞死亡。普通光學顯微鏡下細胞貼壁生長，形態(tài)呈三角梭形，細胞核圓形居中。3組細胞形態(tài)學無明顯差異，培養(yǎng)結(jié)果見圖1。

2.2 原代提取細胞波形蛋白(vimentin)鑒定結(jié)果

3組原代培養(yǎng)的間質(zhì)細胞vimentin表達明顯，改良后原代EMs間質(zhì)細胞提取方法能夠成功提取出間質(zhì)細胞，詳見圖2。

2.3 EMs異位、在位及正常人在位子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白表達差異

EMs異位組織中纖維化相關(guān)蛋白CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達較EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜明顯增高，而EMs在位組織與正常人子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)蛋白的表達無明顯差異。普通免疫組織化學可見淡藍色橢圓形為細胞核，棕色為相關(guān)蛋白的表達水平?？梢钥闯鲎訉m內(nèi)膜異位組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達明顯高于子宮內(nèi)膜在位及正常人子宮內(nèi)膜組織(圖3)。

圖1 光學顯微鏡下觀察原代細胞形態(tài)及大小Fig.1 Morphology of primary cells under light microscope (Scale bar=50 μm)

圖2 免疫組織化學及免疫熒光檢測間質(zhì)細胞波形蛋白表達結(jié)果Fig.2 Detection of vimentin expression in mesenchymal cells by immunohistochemistry and immunofluorescence(Scale bar=25 μm)

HEnESCs：human normal endometrial stromal cells；HEcESCs：human ectopic endometrial stromal cells；HEuESCs：human eutopic endometrial stromal cells.

蛋白免疫印跡法再次檢測EMs異位、在位及正常人在位子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白表達差異，子宮內(nèi)膜異位組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達明顯高于子宮內(nèi)膜在位及正常人子宮內(nèi)膜組織(圖4)。

EMs患者異位病灶組織中3種纖維化相關(guān)蛋白的表達水平與EMs在位子宮內(nèi)膜及正常人子宮內(nèi)膜組織的差異有統(tǒng)計學意義，而EMs在位子宮內(nèi)膜與正常人子宮內(nèi)膜組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(表1、2)。

2.4 間質(zhì)細胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達與組織水平存在一致性

2.4.1 經(jīng)過蛋白免疫印跡定量檢測

EMs患者異位病灶間質(zhì)細胞纖維化相關(guān)蛋白的表達與EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞纖維化相關(guān)蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，通過Bland-Altman方法分析組織及細胞水平纖維化相關(guān)蛋白差異一致性，組織與細胞水平纖維化相關(guān)蛋白的表達存在一致性(圖5)。

2.4.2 統(tǒng)計分析組織水平

HEcESCs中纖維化相關(guān)蛋白的表達水平與HEuESCs及HEnESCs兩組細胞中纖維化相關(guān)蛋白的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而HEuESCs與HEnESCs兩種細胞種纖維化相關(guān)蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表3、4。

3 討論

EMs作為育齡期女性的常見病、多發(fā)病，其生物學特征至今仍不明確。多種發(fā)病學說中經(jīng)血逆流學說較為經(jīng)典并廣為接受[3]。由于經(jīng)血逆流普遍存在于在育齡期婦女，但只有少數(shù)發(fā)展為EMs。針對這一現(xiàn)象目前又有不同的觀點，一種觀點[9-10]認為EMs患者在位子宮內(nèi)膜細胞的特性有關(guān)，逃脫了免疫監(jiān)視和清除而得以在盆腔內(nèi)種植。 另一種觀點[11-12]認為是EMs患者免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常，無法清除正常的逆流經(jīng)血。本實驗通過改良EMs原代細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞，簡化了EMs原代培養(yǎng)的步驟，同時保證了較高培養(yǎng)成功率。本實驗在EMs原代細胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上檢測3組細胞及相應(yīng)組織中纖維化相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果顯示，EMs患者異位病灶組織及間質(zhì)細胞CTGF、α-SMA、Collagen α(1)的表達明顯高于EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜組織及間質(zhì)細胞，而EMs在位內(nèi)膜組織及間質(zhì)細胞與正常人子宮內(nèi)膜組織及間質(zhì)細胞纖維化相關(guān)蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義。同時本研究發(fā)現(xiàn)EMs在位組織與細胞纖維化相關(guān)蛋白表達水平較EMs異位組織及細胞有較大差異，該結(jié)果提示EMs患者在位子宮內(nèi)膜在異位到宮腔外前并沒有表現(xiàn)出纖維化的特征，異位后的子宮內(nèi)膜在異位部位各種條件的誘導(dǎo)下，發(fā)生纖維化，引起了慢性盆腔痛、女性不孕等一系列癥狀，因此異位后的子宮內(nèi)膜在異位部位發(fā)生纖維化過程值得進一步探討。關(guān)于EMs纖維化的具體分子學發(fā)生機制目前尚未明確，本課題組將繼續(xù)對其分子水平的演變過程進行進一步研究。EMs原代細胞培養(yǎng)困難，分離培養(yǎng)過程盡可能滿足以下幾點 ：(1)取材：盡可能選擇新鮮內(nèi)膜異位囊腫，組織獲取后冰盒轉(zhuǎn)運，立刻送往實驗室分離培養(yǎng)。(2)操作：首先取材操作過程中注意無菌原則。組織剪碎過程要盡可能迅速，操作時間延長將提高污染的風險。組織要盡可能剪碎，大塊組織需要延長消化時間，增加消化酶對細胞的損傷。組織消化時間不宜過長，可適當增加消化次數(shù)。(3)培養(yǎng)：首次培養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)可加入5%(體積分數(shù)) 1×PS雙抗減少污染。原代培養(yǎng)的EMs間質(zhì)細胞傳代培養(yǎng)6代內(nèi)能穩(wěn)定生長。本實驗對以往的培養(yǎng)方法加以驗證及改進，摸索出一種簡單、實用的EMs原代細胞分離方法。改進后優(yōu)點：(1)以往以膠原酶和DNaseⅠ混合消化方法，操作步驟繁多，操作時間長，增加了污染機會，本實驗所有消化液一次性按比例混合，減少污染。(2)以往分離方法價格昂貴，加大了相關(guān)實驗的經(jīng)費支出，本實驗采用0.25%(質(zhì)量分數(shù))Ⅳ型膠原酶-胰蛋白酶-EDTA混合液作為消化液，不使用DNA酶，大幅度降低操作成本。(3)本實驗保持較高成功率，為后期EMs相關(guān)實驗提供好的基礎(chǔ)。本實驗，證明了EMs異位病灶組織及間質(zhì)細胞纖維化水平明顯高于EMs在位及正常人子宮內(nèi)膜。明確EMs異位病灶有明顯的纖維化，異位病灶原代分離的間質(zhì)細胞與組織水平纖維化相關(guān)蛋白的表達存在一致性。為后期EMs相關(guān)研究提供突破口及進一步設(shè)計實驗提供基礎(chǔ)。

圖3 免疫組織化學檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常子宮內(nèi)膜組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.3 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and collagen1 in the eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium detected by immunohistochemistry(Scale bar=50 μm)CTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

圖4 蛋白免疫印跡檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常子宮內(nèi)膜組織水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.4 Expression levels of fibrosis-associated proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1) in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial tissues of the endometrium by Western blottingCTGF：connective growth factor；α-SMA：α-smooth muscle actin;EMs：endometriosis.

ProteinEMsectopicEMseutopicControlF/HPCollagenα(1)/actin0.449±0.0580.264±0.0580.231±0.11510.8030.005α-SMA/actin0.546±0.1160.331±0.0970.310±0.07219.593<0.001CTGF/actin0.405±0.0940.231±0.0530.220±0.07911.3640.003 EMs:endometriosis;CTGF:connectivegrowthfactor;α-SMA:α-smoothmuscleactin.

表2 組織水平蛋白表達差異兩兩比較Tab.2 Protein expression differences in two pairs at the tissue level

圖5 蛋白免疫印跡檢測子宮內(nèi)膜在位、異位及正常人子宮內(nèi)膜細胞水平纖維化相關(guān)蛋白CTGF，α-SMA 及Collagen α(1)的表達水平Fig.5 Expression levels of fibrosis-related proteins CTGF，α-SMA and Collagen α(1)in eutopic，ectopic of EMs and normal endometrial cells detected by Western blotting

ProteinControlEMsectopicEMseutopicFPCollagenα(1)/actin0.226±0.0690.621±0.1080.293±0.12533.574<0.001α-SMA/actin0.300±0.1810.595±0.0490.286±0.14812.845<0.001CTGF/actin0.284±0.1210.470±0.0630.273±0.10310.1060.001 EMs:endometriosis;α-SMA:α-smoothmuscleactin;CTGF:connectivegrowthfactor.

表4 細胞水平蛋白表達差異兩兩比較Tab.4 Protein expression differences in two pairs at the cellular level