靈芝提取物對MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬的影響

丁 暉 蔡彥寧 陳 彪

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經(jīng)生物室 首都醫(yī)科大學帕金森病臨床診療與研究中心，北京 100053)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)又稱震顫麻痹，是中老年人常見的神經(jīng)退行性疾病之一，也是中老年人最常見的運動障礙性疾病。目前對PD采用的藥物治療仍然是對癥治療，主要有擬多巴胺化合物、多巴胺受體激動劑、單胺氧化酶抑制劑以及抗膽堿能藥等，它們大多通過增加腦內(nèi)多巴胺濃度或模擬多巴胺效應，提高患者的日常生活自理能力。這些方法手段既不能延緩更不能反轉(zhuǎn)多巴胺能神經(jīng)元的退行性病變過程[1-2]。

靈芝作為藥物已正式被我國國家藥典收載，同時它又是國家批準的新資源食品，無不良反應，可以藥食兩用。靈芝能補氣安神，止咳平喘，用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食等癥狀。靈芝對人體具有雙向調(diào)節(jié)作用，涉及心腦血管、消化、神經(jīng)、內(nèi)分泌、呼吸、運動等各個系統(tǒng)，尤其對腫瘤、肝臟病變、失眠以及衰老的防治作用最為顯著[3]。其藥理作用包括免疫調(diào)節(jié)活性，且與其所含的多糖類成分密切相關。靈芝中發(fā)揮抗腫瘤作用的主要成分是多糖、三萜類成分及甾醇類成分，其中靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝酸、靈芝硒多糖、麥角甾醇、過氧化麥角甾醇均被證實具有顯著的抑癌、抗腫瘤效果。靈芝抗癌機制的研究主要集中在免疫功能、端粒酶、腫瘤細胞分化等方面，其機制與提高宿主免疫功能、抑制端粒酶活性、抑制腫瘤細胞增生、誘導腫瘤細胞凋亡和分化、抗氧化、清除氧自由基等有關[4]。

靈芝能延緩PD患者神經(jīng)退行性病變過程以及對非運動癥狀有著明顯的改善作用[5]。本研究將以靈芝提取物為研究對象，在細胞水平，采用小鼠神經(jīng)瘤細胞Neuro-2a，觀察對多巴胺能特異性神經(jīng)毒素MPP+損傷線粒體功能的影響，并從細胞自噬的角度來觀察靈芝可能發(fā)揮的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

靈芝提取物，由培力(南寧)藥業(yè)公司提供。MPP+iodide購于美國Sigma公司，MitoTracker Red CMXRos探針，購于美國Invitrogen公司，Parkin抗體(Millipore公司，美國)，LC3B抗體、NIX(BNIP/3L)抗體、AMPKα抗體、mTOR抗體、ULK1抗體、PINK1抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

Neuro-2a小鼠腦神經(jīng)瘤細胞，購于中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心。取回細胞后，離心1 000 r/min，5 min，棄上清。用1 mL含有10%(體積分數(shù))胎牛血清的MEM/EBSS培養(yǎng)基重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并按照1∶3比例傳代，2～4 d傳一代。根據(jù)細胞密度，將細胞接種于2～4個培養(yǎng)瓶或利用白細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)，根據(jù)實驗需要，將細胞接種于培養(yǎng)皿或板中，置于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 實驗分組及細胞處理

實驗共分3組，正常對照組(Control組)：培養(yǎng)基、等同體積的PBS和溶解介質(zhì))；模型損傷組1-甲基-4-苯基-吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)組：1 mmol/L 溶于PBS的MPP+和相同體積的溶解介質(zhì))；藥物干預組[M+靈芝提取物(Ganoderma lucidum extract，GLE)組]：1 mmol/L 溶于PBS的MPP+和800 μg/mL 的GLE。在設定的時間點后，終止培養(yǎng)，進行后續(xù)的實驗步驟。

1.4 臺盼藍染色法檢測GLE對MPP+損傷Neuro-2a細胞的保護作用

臺盼藍染色后，通過顯微鏡下拍照后計數(shù)，對細胞病死率進行比較精確的定量。計算公式為：細胞病死率=藍色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。收集對數(shù)期細胞，按實驗需求鋪板，并設置正常對照組，模型損傷組(單獨MPP+處理)以及藥物干預組(MPP+和GLE共同孵育)。每組至少設置3個復孔，設定為6、12和24 h 3個時間段。分別在設定的時間內(nèi)收集細胞：因為Neuro-2a是貼壁細胞，所以先用0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰酶孵育5 min消化下細胞。制作適宜濃度的細胞懸液，進行臺盼藍染色：吸取100 μL重懸的細胞到一塑料離心管內(nèi)，加入100 μL臺盼藍染色液(按1∶1體積比例混合)，輕輕混勻，染色3 min(染色3 min時間已經(jīng)足夠，染色時間可以更長一些但不宜超過10 min)。最后計數(shù)：吸取少量經(jīng)過染色的細胞，用血細胞計數(shù)板計數(shù)。通常如果要比較精確地進行定量，每個細胞樣品至少數(shù)500個細胞，數(shù)出藍色細胞和細胞總數(shù)。根據(jù)上述公式計算出細胞病死率，重復至少3次實驗。

1.5 細胞免疫熒光雙重標記染色

在孵育6 h后，終止培養(yǎng)進行線粒體標記和自噬標志物LC3B的染色。將培養(yǎng)基吸出后，PBS洗3次，裝載探針，滴加事先配制好的線粒體紅色熒光染料：加入37 ℃預熱的0.5μmol/L MitoTracker Red CMXRos染色工作液。在所使用細胞正常培養(yǎng)條件下孵育30 min。染色結束后，使用PBS緩沖液小心清洗。4%(質(zhì)量分數(shù))多聚甲醛固定15～30 min。直接加入含有0.3%(體積分數(shù)) Triton X-100的PBST緩沖液中孵育進行細胞透化。之后用PBS清洗細胞3次。滴加10%(體積分數(shù))胎牛血清封閉液，室溫封閉1 h，傾去，勿洗。滴加按比例稀釋的一抗(LC3B，1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，每次10 min。滴加相應的二抗，37 ℃孵育1 h。PBS洗3次，每次10 min。滴加DAPI復染，作用1 min。再滴加抗熒光淬滅封片劑。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察、照相采集。

1.6 免疫蛋白印跡法檢測

收集和上述實驗處理相同的各組細胞，用RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定各組蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后，進行轉(zhuǎn)膜，200 mA恒流電轉(zhuǎn)0.5～1.5 h(根據(jù)目的蛋白相對分子質(zhì)量不同，所需轉(zhuǎn)膜時間不同)。加入5 %(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉常溫封閉2 h。去除封閉液，加入事先按比例稀釋好的一抗AMPKα、mTOR、ULK1、LC3B、NIX、PINK1 (1∶1 000)，Parkin (1∶200)和β-actin (1∶1 000)，4 ℃過夜；然后依據(jù)步驟常規(guī)洗滌，加入稀釋好的相應二抗，室溫孵育1 h。最后使用ECL發(fā)光液進行蛋白灰度檢測，灰度強度使用Gel-Pro分析儀對其進行分析和比較。β-actin在所有Western blotting印跡分析中用作各樣品表達對照。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 靈芝提取物對MPP+誘導的Neuro-2a的細胞病死率的影響

本研究用臺盼藍染色法對GLE的保護作用進行驗證，與Control組相比，MPP+組細胞病死率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，并且隨著時間的延長，MPP+組的細胞病死率逐漸升高，6 h細胞病死率為5.89%，至24 h，細胞病死率升高至20.42%。而與MPP+組相比較，GLE組細胞分別由5.89%降至3.82(6 h，P<0.001)，7.32%降至4.77%(12 h，P<0.05)以及20.42%降至8.11%(24 h，P<0.001)(圖1)。

圖1 靈芝提取物(GLE)對MPP+誘導的Neuro-2a細胞病死率的影響Fig.1 Effects of GLE on the cell death in Neuro-2a cells treated with MPP+

The cells were treated with or without GLE(800 μg/mL) for three time periods of 6，12 and 24 hours in Neuro-2a cells challenged with MPP+，***P<0.001vscontrol group，#P<0.05，###P<0.001vsMPP+group，n=3；GLE：Ganoderma lucidum extract；MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

2.2 靈芝提取物對MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬反應的影響

首先采用LC3抗體進行細胞免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡觀察到，正常組細胞LC3-Ⅰ綠色熒光在胞質(zhì)內(nèi)彌散分布，MPP+處理組LC3-Ⅱ聚集于自噬體膜上，觀察到呈點狀聚集狀態(tài)(圖2A)，與正常對照組相比，MPP+組呈綠色點狀分布的LC3陽性細胞百分比明顯升高(P<0.001)；而與MPP+模型組相比，GLE組呈綠色點狀分布的LC3陽性細胞百分比明顯降低(P<0.001)(圖2B)。

2.3 靈芝提取物對MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬標志蛋白表達的影響

NIX有76 000和38 000兩個目標條帶，其中38 000條帶比較清楚，大相對分子質(zhì)量條帶比較淺細。Neuro-2a細胞在未作任何處理時，幾乎看不到LC3-Ⅱ。其余組都能同時看到LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。對免疫印跡進行灰密度值量化，3組間NIX的灰密度值，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值做統(tǒng)計學分析，與正常組比較，MPP+組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加，而與模型組相比，GLE組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著降低(圖3)。

2.4 靈芝提取物對MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬調(diào)節(jié)蛋白AMPK-mTOR-ULK1的影響

與Control組相比，MPP+組細胞AMPKα/mTOR/ULK1表達水平逐漸降低，尤以ULK1更為顯著。而與模型組相比，GLE干預組細胞的AMPKα/mTOR/ULK1顯著增加(圖4)。

圖2 GLE減輕MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬反應Fig.2 GLE administration regulated autophagy induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A:confocal images of LC3B (green) and mitochondria (MitoTracker dye，red). Nuclei were counterstained with 4′，6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI，blue). Cells were treated with MPP+in the absence or presence of GLE (800 μg/mL) for 6 h. Scale bar=20 μm;B: quantification of the percentage of cells with LC3 punctate staining.***P<0.001vscontrol group，###P<0.001vsMPP+group，n=3.MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium；GLE：Ganoderma lucidum extract.

圖3 GLE調(diào)節(jié)細胞自噬標志蛋白的表達Fig.3 GLE regulated autophagic proteins induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A: expression level of NIX and LC3B using Western blotting method;B: statistical results of NIX and LC3B,n=3,**P<0.01vscontrol group，#P<0.05vsMPP+group.GLE：Ganoderma lucidum extract;MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

圖4 GLE調(diào)節(jié)細胞自噬相關蛋白的表達Fig.4 GLE regulated autophagic-related proteins induced by MPP+ in Neuro-2a cell lines

A: expression level of AMPK-mTOR-ULK1 by Western blotting;B: statistical results of AMPK-mTOR-ULK1,n=3,***P<0.001vscontrol group;GLE：Ganoderma lucidum extract;MPP+：1-methyl-4-phenylpyridinium.

3 討論

細胞內(nèi)存在兩種形式的自噬標志物LC3蛋白：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。自噬形成時，胞質(zhì)型LC3(即LC3-Ⅰ，16 000)會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-Ⅱ，14 000)。

基于上述GLE在MPP+損傷情況下對反應性細胞自噬的抑制作用，筆者進一步觀察其對上游調(diào)節(jié)蛋白表達水平的影響。

AMPK-mTOR-ULK1/2信號通路在自噬反應過程中有著非常復雜、精細的正、負反饋調(diào)節(jié)。AMPK和mTOR直接磷酸化ULK1從而負向調(diào)節(jié)(抑制)ULK1活性，反過來活化的ULK1可以直接磷酸化AMPK，抑制AMPK的激活，形成自噬起始負反饋閉合環(huán)[5]。

靈芝是一種藥用真菌，一直以來在亞洲地區(qū)被廣泛用于促進健康和長壽的民間療法。它在許多疾病中有治療作用，如心血管疾病、糖尿病、癌癥、炎性反應和免疫相關疾病。靈芝也被證明具有神經(jīng)保護作用在腦缺血性損傷、癲癇、阿爾茨海默病，PD和亨廷頓氏病[6-8]。研究[9]顯示，靈芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharide，GLP)可通過抗氧化作用防止MPP+和魚藤酮誘導的原代多巴胺能細胞凋亡。此外，本團隊之前的臨床研究證實了GLE可以延緩臨床PD患者的進程以及改善非運動癥狀。同時本課題組前期證明GLE可以減輕MPP+誘導的Neuro-2a細胞線粒體功能障礙。本研究臺盼藍染色結果表明GLE組的細胞病死率明顯下降，進一步確定了GLE能夠減輕MPP+致Neuro-2a細胞的死亡。GL調(diào)節(jié)自噬的機制尚不明確。本研究結果進一步表明神經(jīng)毒素MPP+作用于Neuro-2a細胞數(shù)小時后，啟動了異常自噬的激活。它是一種保守的細胞自我降解方式，是將受損細胞器及大分子物質(zhì)通過溶酶體降解再利用的過程。自噬參與細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)對于神經(jīng)元尤為如此，特別是衰老的腦組織。神經(jīng)元對自噬的依賴是顯而易見的。毫無疑問，隨著衰老等因素的增加，神經(jīng)元自噬功能失調(diào)，大量異常的、未降解的蛋白聚集，造成神經(jīng)元的退行性病變過程[10]。本研究利用MPP+作用Neuro-2a細胞數(shù)小時后，GLE可以顯著降低LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值，證明GLE能夠降低MPP+誘導的Neuro-2a細胞自噬反應。同時筆者發(fā)現(xiàn)，GLE可以減輕MPP+誘導的自噬相關蛋白NIX表達的下降。NIX，又稱BNIP3L，定位于線粒體外膜(outer membrane of mitochondria，OMM)，負責受損線粒體的清除。在執(zhí)行其生物學功能時，作為Parkin的底物驅(qū)動Parkin介導的線粒體自噬。Gao等[11]在人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞中發(fā)現(xiàn)，使用線粒體復合物抑制劑MPP+進行損傷處理后，NIX的表達水平下降，這與本實驗結果相似，MPP+損傷Neuro-2a細胞6 h后，導致NIX蛋白的表達水平下降，但差異無統(tǒng)計學意義。

調(diào)節(jié)自噬的相關基因突變或者相關蛋白表達水平的變化會導致年齡譜異常的神經(jīng)變性疾病[12-13]。自噬異常發(fā)生在帕金森病病程中的多個階段，表現(xiàn)為受累神經(jīng)元中路易小體(主要成分為突觸核蛋白)的聚集。同時在晚發(fā)型帕金森病中，起病發(fā)生在自噬通路的不同階段，那么病理機制和治療也會有相應的不同。

本研究對調(diào)節(jié)自噬的相關蛋白，AMPKα/mTOR/ULK1通路中各蛋白的蛋白表達水平進行了檢測，觀察GLE是否通過調(diào)節(jié)這些蛋白的表達水平參與了自噬的調(diào)節(jié)。在本次研究中，在正常條件下，各相關自噬蛋白表達水平維持在一定水平。而相比與正常組，在MPP+損傷條件下，幾乎所有的自噬相關蛋白的表達是下調(diào)的，有理由認為在正常條件下，細胞內(nèi)蛋白維持在正常的水平，可以把它理解為“冗余”，當然這種冗余包括了數(shù)量和質(zhì)量，使得細胞有能力去緩沖各種環(huán)境的變化。Inoki等[14]也表達了相似的觀點，他們認為細胞功能和信號通路的冗余為系統(tǒng)提供了一個安全的機制。在功能失常的細胞或者線粒體內(nèi)，蛋白表達的下調(diào)已經(jīng)不足以對抗損傷引起的信號反應(自噬)，至于蛋白下調(diào)與這種病理損傷的結果如何相互作用仍需要進一步深入研究。自噬性修復能力下降與自噬性反應的增加，自噬這種雙重身份的失衡，也就是所謂的自噬功能障礙，最終導致部分認為的細胞死亡[14]。

MPTP+線粒體損傷都可以引起自噬，不好區(qū)分，但筆者更加認為有重疊的成分，因為MPP+通過抑制線粒體復合物而引起膜電位下降，ROS增多以及ATP的下降。這里本身就存在線粒體損傷和能量缺乏兩個病理性刺激因素，二者之間相互作用，導致自噬性和凋亡性的病理過程，惡性循環(huán)導致細胞的死亡，當然ATP下降的速度如此之快，因而可以作為感應因素，去調(diào)節(jié)下游的反應。而GLE通過改善這種病理刺激，讓細胞本身及其所在的環(huán)境趨于穩(wěn)態(tài)，細胞得以存活下來，這本身也是中藥的優(yōu)勢。

GLE中哪些成分介導其在自噬反應中的功能也并不清楚的。藥理學分析表明GLE是高度復雜的混合物。GLE的成分包括多糖、三萜類化合物、類固醇、多肽、真菌溶菌酶、麥角甾醇等。在這些組分中，通常認為多糖是主要活性成分具有抗氧化，抗腫瘤和免疫刺激劑的物質(zhì)屬性。 GLP可以預防腎臟、肝臟、心肌和神經(jīng)細胞的氧化應激。特別是，GLP是通過提升線粒體復合物I來保護DA神經(jīng)元免受MPP+和魚藤酮誘導的氧化應激活性和減少ROS的形成[9]。另外也有報道[15-16]，其他多糖比如附子多糖等可以通過激活細胞增加自噬AMPK/mTOR通路防止細胞毒性，因此筆者推斷GLP可能是GL調(diào)節(jié)自噬的主要成分之一。