他莫昔芬治療轉染孕激素受體膜組分1乳腺癌裸鼠模型對乳腺腫瘤組織Ki-67表達的影響

張凌燕 阮祥燕* 蔡桂舉 谷牧青 Alfred O．Mueck,2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院內分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學婦產醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國)

乳腺癌是世界范圍內女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，是女性死亡的主要原因[1]。乳腺癌的發(fā)病原因與雌激素受體(estrogen receptor，ER)的作用密切相關，孕激素受體膜組分1(progesterone receptor membrane component 1，PGRMC1)與雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)之間在乳腺癌細胞增生過程中可能存在一定的交互作用[2]，即ERα可能在雌激素或雌孕激素作用下由PGRMC1介導的信號通路中發(fā)揮重要作用。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)等內分泌治療在激素受體(hormone receptor，HR)陽性乳腺癌的術后輔助治療、晚期乳腺癌的一線治療中均發(fā)揮著重要的作用。目前，常用的內分泌治療藥物包括抗雌激素藥物、芳香化酶抑制劑、促黃體生成素釋放激素類似物和孕酮制劑等。TAM是最常用的非甾體類抗雌激素藥物，于20世紀70年代開始應用于乳腺癌患者的治療。目前關于PGRMC1和TAM之間的相互作用尚未報道，本文就TAM對轉染PGRMC1乳腺癌裸鼠模型MCF-7乳腺腫瘤Ki-67的表達影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 細胞

乳腺癌MCF-7細胞系購自美國標準培養(yǎng)庫。

1.2 細胞培養(yǎng)

將MCF-7乳腺癌細胞系培養(yǎng)于含10%(體積分數)熱滅活胎牛血清、25 mmol/L HEPES以及1%(質量分數)青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中。在37 ℃ 5%(體積分數)CO2(細胞培養(yǎng)箱中)進行孵育，待細胞融合率達90%時進行傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染

MCF-7細胞轉染HA標記的PGRMC1(MCF-7-HA-PGRMC1)或空質粒(MCF-7-HA-vector)，48 h后，用G418進行為期3周的單克隆篩選。使用PCR技術將轉染的PGRMC1 cDNA與內源性PGRMC1進行區(qū)分。為避免轉染試劑的影響，將MCF-7-HA-vector設置為對照組。最后，Western blotting法檢測MCF-7-HA-PGRMC1及MCF-7-HA-vector的PGRMC1表達情況。

1.4 動物分組及實驗方法

本研究為排除裸鼠本身雌激素分泌對實驗結果的影響，無菌環(huán)境下全身麻醉(以下簡稱全麻)后，行去勢手術，并在裸鼠頸部皮下包埋17β-雌激素(estradiol, E2)緩釋片。包埋雌激素緩釋片48 h后，將上述小鼠按體質量數字表法隨機分為兩組，進行后期的PGRMC1轉染等處理。本課題主要研究乳腺癌，基礎水平的E2為裸鼠體內作為異種移植物的激素反應細胞生長所必需。

1.4.1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1鼠中的表達

上述BALB/c雌性裸鼠48只，無菌環(huán)境下全麻后，行去勢手術后采用數字表法隨機分為兩組，每組24只，實驗組(MCF-7/PGRMC1組)于裸鼠的左右側面皮下注射等量的1×107個MCF-7-HA-/PGRMC1細胞，對照組(MCF-7/vectorr組)于裸鼠的左右側面皮下注射等量的1×107個MCF-7-HA-vector細胞。

1.4.2 他莫昔芬對MCF-7/PGRMC1鼠Ki-67表達的影響

至種瘤的第43天，按腫瘤體積大小分別再將兩組裸鼠各自采用數字表法隨機分為4個亞組，每組6只。各亞組裸鼠分別加用玉米油、黃體酮、他莫昔芬、他莫昔芬聯(lián)合黃體酮處理。其中，黃體酮為緩釋片(10 mg/60 d)，他莫昔芬100 μL腹腔注射劑(5 mg/mL)(3 d給藥+1 d停藥，共4周)。種瘤56 d后實施安樂死，無菌操作下完整摘除腫瘤組織，免疫組織化學法(immunohistochemistry, IHC)檢測荷瘤體中Ki-67表達情況。

1.5 IHC測定Ki-67蛋白水平

將裸鼠移植瘤切成3 μm厚度后進行IHC檢測Ki-67的表達情況。常規(guī)石蠟切片，恒溫箱烘烤，脫蠟水化，水化按說明書進行操作。組織切片在干燥箱(上?；厶﹥x器制造有限公司，型號DHG-9140A)中脫蠟加熱至少12 h，600 ℃，以揭示抗原位點。切片在自動模式下使用Ventana基準GX染色(美國Ventana Medical Systems公司)用于Ki-67的評估。Ki-67兔抗人單克隆抗體(GB13030-2，武漢Servicebio公司)；IHC二抗檢測試劑盒(編號GB23204，武漢Servicebio公司)，DAB緩沖液及DAB原液(編號G1211，武漢Servicebio公司)。試驗過程按照試劑盒說明進行，蘇木素襯染。

1.6 免疫染色的評估

IHC結果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB顯出的陽性表達為棕黃色。

應用半定量分析方法對腫瘤組織中的Ki-67進行評分，評分依據為染色強度(弱、中、強)和核免疫染色陽性細胞所占百分比(范圍：0～100%)。對隨機選擇的3個乳腺組織切片進行計數放大到400倍。當染色均勻時，計數兩個邊緣區(qū)域和一個中心區(qū)域來進行腫瘤異質性的分級。評分范圍在0 ～ 100%之間，陽性分界值為14%。由兩名病理學家分別對Ki-67的IHC評分進行評估。每個部位分別記錄腫瘤細胞和鄰近正常上皮細胞的染色分數。記錄免疫染色百分率及染色強度(0：陰性；1+：弱；2+：中等強度；3+：強)。H-score的計算公式如下: H-score=(強度較弱%×1)+(中等強度%×2)+(強度較強×3)；最大H值為300，對應100%強度較強細胞。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vector乳腺腫瘤組織中的表達

與轉染空載體的乳腺癌細胞MCF-7(MCF-7/vector)相比，穩(wěn)定表達PGRMC1的乳腺癌細胞MCF-7腫瘤模型乳腺腫瘤組織中的Ki-67表達明顯升高(P<0.001)，差異有統(tǒng)計學意義，詳見表1。

2.2 他莫昔芬對MCF-7/PGRMC1裸鼠乳腺腫瘤組織Ki-67表達的影響

在轉染PGRMC1裸鼠組，與單獨給予E2相比，E2+TAM聯(lián)合治療可降低腫瘤組織中Ki-67的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。而給予E2+黃體酮并未促進Ki-67的表達(P>0.05)。與單獨給予E2相比，E2+黃體酮+TAM中Ki-67的表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，詳見圖1，表2。

圖1 MCF-7/PGRMC1各亞組裸鼠乳腺腫瘤組織中Ki-67表達的比較Fig.1 Comparison of Ki-67 in breast cancer tissues of MCF-PGRMC1 subgroups

E2：estradiol；Prog:progesterone;TAM:tamoxifen;PGRMC1:.progesterone receptor membrane component 1；***P<0.001vsE2 group.

2.3 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vecter乳腺腫瘤組織中IHC結果

與轉染空載體的乳腺癌細胞MCF-7相比，穩(wěn)定表達PGRMC1的乳腺癌細胞MCF-7腫瘤模型乳腺腫瘤組織中的Ki-67陽性率明顯升高，詳見圖2。

表1 Ki-67在MCF-7/PGRMC1及MCF-7/vector乳腺腫瘤組織中的表達Tab.1 Comparison of Ki-67 in MCF-7/PGRMC1 and MCF-7/vector breast tumor tissues

表2 他莫昔芬對MCF-7/PGRMC1裸鼠乳腺腫瘤組織Ki-67表達的比較Tab.2 Comparison of tamoxifen on the expressionin of Ki-67 in breast tumor tissues of MCF-7/PGRMC1 nude mice

圖2 Ki-67在乳腺腫瘤組織中的表達Fig.2 Expression of Ki-67 in breast tumor tissue from mice

Scalebars：100 μm， signals for Ki-67 brown colour, nuclei blue；E2：estradiol；Prog:progesterone;TAM:tamoxifen;PGRMC1:progesterone receptor membrane component 1.

3 討論

乳腺癌是我國女性發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率年增幅是世界平均水平的2倍，發(fā)病高峰為40～50歲，相較于美國乳腺癌患者的中位診斷年齡64歲，中國約48～50歲，比歐美國家提前約15年[3]。Beatson于1896年發(fā)現切除乳腺癌患者的卵巢后其乳腺腫瘤病灶會縮小，表明乳腺腫瘤的生長需依賴于內分泌環(huán)境，雌激素能促進乳腺腫瘤的發(fā)生[4]，而內分泌治療可阻斷乳腺腫瘤生長環(huán)境，使細胞的增生于G0 /G1期停止，達到縮小腫瘤的效果，故內分泌治療逐漸被應用于乳腺癌的治療[5]。美國國立衛(wèi)生研究所推薦TAM為所有ER陽性的乳腺癌患者術后輔助治療的標準藥物，其也是第一個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用來減少絕經前、后乳腺癌婦女高危因素的腫瘤化學預防藥物[6-7]。

TAM是一種結構與雌激素相似的人工合成的非甾體類抗雌激素藥，屬于雌激素受體調節(jié)劑，通過與雌激素競爭靶細胞胞質中的ERα，抑制ERα功能，阻止雌激素發(fā)揮作用從而抑制乳腺癌細胞的增生[8]，是ERα陽性乳腺癌患者內分泌治療的首選藥物。TAM須在肝臟內進行代謝，最終代謝為4-羥基-他莫昔芬和4-羥基-N-去甲他莫昔芬(吲哚昔芬)，后兩者的活性是他莫昔芬的100倍。由于吲哚昔芬的血漿濃度高，能夠顯著抑制ER陽性乳腺癌細胞的增生能力。所以通常認為吲哚昔芬是TAM的主要代謝活性物質，在抗雌激素治療中起重要作用[9]。研究[10]表明，TAM能夠顯著減低ERα 陽性乳腺癌患者的病死率，接受TAM治療能顯著降低乳腺癌的復發(fā)及對側乳腺癌的發(fā)生風險，服用TAM 5年后，復發(fā)風險在 50～<60歲女性中降低 37%，在 60～<70歲女性中降低54%，持續(xù)服用10年能顯著降低乳腺癌的復發(fā)率和病死率。

在我國應用TAM治療5～10年已經成為絕經前激素受體陽性早期乳腺癌患者的標準內分泌治療方式[10]，但我國絕經前女性早期乳腺癌患者中激素受體陽性者僅占50%～60%。另外，在不同的組織、靶器官中，TAM可體現不同作用，即對乳腺組織主要發(fā)揮雌激素受體的拮抗作用，而對于子宮則主要表現弱雌激素活性。因為TAM化學結構與雌激素相似，存在Z和E兩種構型，Z型具有抗雌激素樣作用，E型卻具有弱雌激素活性，而TAM在不同組織中分布不同[11]，故當TAM抑制ER陽性的乳腺癌細胞生長時，卻刺激子宮內膜細胞增生，子宮內膜腺體呈囊性擴張樣水腫或形成息肉，腺上皮細胞萎縮或化生，使子宮內膜呈現息肉-增生-惡性變的變化過程[12]。癌癥基因組圖譜研究[10-11]顯示，長期應用TAM 10 年和 5 年的子宮內膜癌發(fā)生率分別為3.1%和1.6%，但相較于TAM能顯著降低乳腺癌患者復發(fā)風險，其對于子宮內膜的不良影響仍無法替代其在乳腺癌治療中的使用地位。

PGRMC1是一種新的乳腺癌細胞膜七跨膜受體，有一個短的胞外結構域及跨膜域和胞質域，屬于廣泛存在于真核生物中的膜相關的孕激素受體蛋白 ( membrane-associated progesterone receptor protein，MAPR) 家族。PGRMC1在介導孕激素的非基因組效應中發(fā)揮重要作用，在體內參與卵泡發(fā)育、精子的頂體反應等生理過程；還能夠與血紅素直接結合激活細胞色素P450參與調節(jié)體內類固醇、藥物代謝及性激素的合成[13]。此外，多種腫瘤中均發(fā)現PGRMC1表達異常，如乳腺癌[14-16]、卵巢癌、肺癌等。本課題組前期研究[17]顯示：體外雌、孕激素對MCF-7 /PGRMC1與未轉染 PGRMC1 的乳腺癌細胞(MCF-7)增生作用有明顯不同，雌激素和某些孕激素明顯增加了轉染PGRMC1的乳腺癌細胞的增生，并可能參與腫瘤的發(fā)生；且PGRMC1與腫瘤直徑、淋巴結轉移之間關系密切，根據PGRMC1的不同陽性表達水平來分析 PGRMC1與乳腺癌患者復發(fā)、遠期生存情況之間的關系發(fā)現：在總體生存率方面，隨著PGRMC1表達強度逐漸增強，患者總體生存率下降；在無瘤生存率方面，隨著PGRMC1表達陽性水平增加，遠期術后復發(fā)時間間隔短[18]。因此，PGRMC1是乳腺癌的獨立預后因子，對于ERα表達陽性的個體，還可以通過評估 PGRMC1表達水平對患者預后做出更好的預測。Peluso等[19]發(fā)現PGRMC1除了在腫瘤形成中起著重要作用，敲除PGRMC1后卵巢癌細胞SKOV-3成瘤下降，成瘤小鼠的成瘤大小減少55%，且缺失PGRMC1，SKOV-3更容易對順鉑耐藥。因此，明確PGRMC1與TAM的相互作用有助于腫瘤的病因、預后及耐藥學研究。

自2013年6月免疫組織化學問世以來，乳腺癌的治療基于ER、孕激素受體和人類表皮生長因子受體2狀態(tài)，而Ki-67的測定及其與臨床病理參數的關系具有預后和預測意義[20]。Ki-67是細胞增生標志物，其表達增強是細胞增生活性增強的可靠標記，該標志物在乳腺癌臨床治療中具重要意義：Ki-67與腫瘤分級有一定的關聯(lián)，Ki-67與乳腺癌患者其他生物學標志物之間的關系也是一直以來研究的內容。根據1991年Elston和Ellis標準[21]，有絲分裂活動是乳腺癌分級系統(tǒng)的三個主要組成部分之一，除了G0靜止期外，Ki-67增生指數存在于細胞周期的不同階段。Ki-67表達水平與腫瘤分級呈正相關。腫瘤分級越高，Ki-67表達越高。反之亦然，Ki-67表達越高，腫瘤分級越高，惡性腫瘤的侵襲性也越強，對患者的生存造成的危害越大，如早期復發(fā)、轉移。除了腫瘤分級外，Aman等[22]研究發(fā)現Ki-67的表達是一個連續(xù)變量，還與組織學類型、分子亞型、ER、PR有關。ER、PR陽性者Ki-67表達較低，而HER2在Ki-67高表達患者中也呈高表達狀態(tài)。Ki-67增殖生數和諾丁漢分級明確了乳腺癌的侵襲性，從而證實了其預后意義。王志新等[23]對 42 例絕經后乳腺癌患者服用TAM后子宮內膜中 Ki-67及pten基因的表達進行測定，結果顯示，與對照組相比，TAM組表現出Ki-67高表達及pten低表達或缺如。Ki-67高表達引起內膜細胞增生、pten基因突變，其對抑癌作用的抑制可能是TAM治療者發(fā)生子宮內膜病變的發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)。本研究結果與既往報道[22]一致：腫瘤組織中Ki-67高表達；E2+TAM及E2+黃體酮+TAM聯(lián)合治療可降低腫瘤組織中Ki-67的表達，免疫組織化學的結果與上述一致。在本實驗室前期工作證明，PGRMC1可以使腫瘤細胞生長曲線加快、加入TAM后腫瘤生長曲線速度減慢。故推測PGRMC1可能通過加快細胞增生、增加Ki-67表達來促進腫瘤生長，而TAM治療后可通過降低Ki-67表達拮抗PGRMC1導致的乳腺腫瘤細胞增生。

綜上所述，PGRMC1作為細胞膜受體，可能通過加快細胞增生、增加Ki-67表達來促進乳腺腫瘤生長，后期可通過驗證TAM對于轉染PGRMC1腫瘤子宮內膜影響，進一步明確PGRMC1表達水平與TAM所致子宮內膜增厚之間的關系，可能為乳腺癌的內分泌治療方案及子宮內膜增厚的預防制定提供新思路。