腸內(nèi)營養(yǎng)對(duì)缺血性腦卒中患者腸道菌群的影響

范春江，劉庭玉，李剛，黃建，曹揚(yáng)，黨旖旎

1.無錫市康復(fù)醫(yī)院（無錫市殘疾人康復(fù)中心）康復(fù)科，江蘇無錫市214043；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院消化內(nèi)科，上海市201799；3.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（江蘇省人民醫(yī)院）消化內(nèi)科，江蘇南京市210029

缺血性腦卒中是指由于腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧引起局限性腦組織缺血、壞死或腦軟化，具有發(fā)病率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高及致殘率高等特點(diǎn)[1]。我國腦卒中亞型中，近70%為缺血性腦卒中[2]?？祻?fù)治療在缺血性腦卒中綜合治療中起著重要作用，對(duì)改善患者神經(jīng)和肢體運(yùn)動(dòng)功能，提高生活質(zhì)量起到積極作用。

消化康復(fù)是康復(fù)治療中的重要組成部分，經(jīng)過嚴(yán)格規(guī)范的營養(yǎng)治療可以達(dá)到改善卒中患者預(yù)后的目的[3]。腸道微生態(tài)(gut microbiota)是腸道微生物與其宿主在進(jìn)化過程中共同形成的統(tǒng)一體，與人類的健康息息相關(guān)。隨著人體腸道微生物群落基因組研究的不斷深入，越來越多的分子生物學(xué)證據(jù)揭示，腸道微生物群落不僅參與和調(diào)控機(jī)體的生理功能，還通過腸-腦軸影響缺血性腦卒中的預(yù)后[4]。

本研究旨在探討腸內(nèi)營養(yǎng)是否可促進(jìn)恢復(fù)期缺血性腦卒中的康復(fù)及其可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月20日至4月22日在無錫市殘疾人康復(fù)中心住院治療的恢復(fù)期缺血性腦卒中患者，符合1995年第四屆全國腦血管病會(huì)議制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)頭顱CT或MRⅠ證實(shí)為缺血性腦卒中。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①Fujishima評(píng)分[5]為1～6分；②能夠配合治療；③簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①短暫性腦缺血發(fā)作；②蛛網(wǎng)膜下腔出血；③并發(fā)嚴(yán)重的內(nèi)分泌和代謝性疾??；③并發(fā)嚴(yán)重的肝腎功能障礙；⑤并發(fā)慢性心肺功能不全；⑥并發(fā)消化道應(yīng)激性潰瘍；⑦并發(fā)血液系統(tǒng)疾病；⑧并發(fā)惡性腫瘤；⑨接受溶栓治療；⑩入組前3個(gè)月內(nèi)服用過益生菌制劑。

共121例患者入組，其中男性43例，女性78例，平均年齡為(79.6±9.43)歲；并發(fā)癥中以高血壓居多；卒中類型以TOAST分型Ⅲ型(小動(dòng)脈閉塞性卒中或腔隙性卒中)為主(75.2%)，另有30例Ⅰ型(大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中)。見表1。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(No.KFYYLL-001)。

表1 患者一般資料(n=121)

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)治療

所有入組患者均予抗血小板凝集、抗凝及他汀類藥物治療?？祻?fù)訓(xùn)練包括偏癱肢體綜合訓(xùn)練、運(yùn)動(dòng)治療、作業(yè)治療、吞咽功能訓(xùn)練、中頻脈沖電治療和紅外線治療等。觀察期間持續(xù)治療。

1.2.2 腸內(nèi)營養(yǎng)方案

取腸內(nèi)營養(yǎng)混懸液(TPF，能全力，紐迪希亞制藥有限公司，批號(hào)H20010284)，以及由本院營養(yǎng)師依據(jù)患者體質(zhì)量、營養(yǎng)狀況和病情配置高能營養(yǎng)液，熱量按每天83.68～125.52 kJ/kg提供。由專職護(hù)士負(fù)責(zé)，通過鼻飼管靜滴，滴速40～60 ml/h，若無腹瀉、腹脹、反流等不良反應(yīng)，則持續(xù)注入。每天2次，每次500 ml。每3～4小時(shí)檢查胃潴留量，若大于150 ml，暫停腸內(nèi)營養(yǎng)2～4 h。治療1周。

1.2.3 營養(yǎng)狀況評(píng)定

采用營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)篩查表(Nutrition Risk Screening,NRS2002)對(duì)所有患者于入院時(shí)、干預(yù)后1周和1個(gè)月時(shí)分別進(jìn)行營養(yǎng)狀況評(píng)定，同時(shí)檢測(cè)患者血漿蛋白和肝腎功能等指標(biāo)。

1.2.4 腸道菌群檢測(cè)

囑患者在入院時(shí)、干預(yù)后1周和1個(gè)月時(shí)留取新鮮糞便標(biāo)本約10 g。分離、提取、純化和檢測(cè)總DNA，行16SrDNA可變區(qū)PCR擴(kuò)增和測(cè)序，最后進(jìn)行菌種鑒定和生物信息學(xué)分析。

生物信息學(xué)分析包括：①數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通過Ⅰllumina平臺(tái)(HiSeq或者M(jìn)iSeq)進(jìn)行Paired-end測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過去除低質(zhì)量reads，每個(gè)樣本獲得Clean Data；②序列拼接，使用軟件FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads,v1.2.11)，利用重疊關(guān)系將雙末端測(cè)序得到的成對(duì)reads組裝成一條序列，得到高變區(qū)的Tags；③物種分類和豐度分析，將經(jīng)過上述處理的Clean Tags進(jìn)行OTU聚類，然后通過對(duì)OTU注釋完成OTU的物種分類，并進(jìn)行OTU及其豐度分析。

物種及其豐度分析采用observed species指數(shù)、chao指數(shù)和ace指數(shù)。它們反映患者腸道菌群中群落的豐度(species richness)，即簡單指群落中物種的數(shù)量，而不考慮群落中每個(gè)物種的豐度情況。指數(shù)越高，說明標(biāo)本中的物種越豐度。

多樣性分析采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。它們反映群落的多樣性(species diversity)。受樣品群落中物種豐度(species richness)和物種均勻度(species evenness)的影響，在相同物種豐度的情況下，群落中各物種具有越大的均勻度，則認(rèn)為群落具有越大的多樣性。Shannon指數(shù)越高，說明標(biāo)本中物種多樣性越大，Simpson指數(shù)越小說明標(biāo)本中的物種多樣性越大。

1.2.5 炎癥因子檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子。

囑患者在入院時(shí)、干預(yù)后1周和1個(gè)月時(shí)留取外周血，分離血清，凍存于-80℃待用。嚴(yán)格按照試劑盒(R&D公司)說明書進(jìn)行操作，測(cè)量吸光度值，使用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算血清樣本中腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,ⅠL)-1α、ⅠL-1β、ⅠL-6和ⅠL-8的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 營養(yǎng)狀況

入院時(shí)患者營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為(3.4±1.26)分，血漿總蛋白和白蛋白分別為(66.13±5.21)g/L和(31.98±4.23)g/L。

干預(yù)后1周時(shí)營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為(3.3±1.38)分，與入院時(shí)相比接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血漿總蛋白和白蛋白分別為(67.89±6.52)g/L和(33.15±5.37)g/L，與入院時(shí)相比無明顯增高(P＞0.05)。

干預(yù)后1個(gè)月時(shí)營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為(2.9±1.69)分，與入院時(shí)相比下降(P＜0.05)；血漿總蛋白和白蛋白分別為(71.94±4.91)g/L和(36.86±3.59)g/L，與入院時(shí)相比增高(P＜0.05)。

2.2 腸道菌群

選取10例患者進(jìn)行16SrDNA基因序列分析，以檢測(cè)腸道菌群。

2.2.1 腸道菌群OTU個(gè)數(shù)

在97%相似度下，得到每個(gè)樣品的OTU個(gè)數(shù)。OTU Venn圖可以顯示干預(yù)前后共有OTU數(shù)目以及各自特有OTU數(shù)目。入院時(shí)、干預(yù)后1周和1個(gè)月時(shí)患者OTU數(shù)目分別為599、1177和566?；颊呷朐簳r(shí)與1周時(shí)共有518個(gè)OTU，入院時(shí)與1個(gè)月時(shí)共有503個(gè)OTU，1周與1個(gè)月時(shí)共有510個(gè)OTU，而三組共有的OTU數(shù)目為465。見圖1。

圖1 腸內(nèi)營養(yǎng)治療前后腸道菌群OTU Venn圖分析

2.2.2 腸道菌群物種

通過與數(shù)據(jù)庫比對(duì)，分別在門水平和種水平對(duì)OTU物種樣品做物種profiling面積圖和柱狀圖。見圖2。

在門水平，干預(yù)前優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，共占細(xì)菌門類90%以上；干預(yù)后1周優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門、變形菌門、疣微菌門(Verrucomicrobia)和厚壁菌門，共占細(xì)菌門類95%以上；干預(yù)后1個(gè)月優(yōu)勢(shì)菌門為擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門，共占細(xì)菌門類85%以上。

在種水平，大部分均為未分類菌種，其余菌種在干預(yù)前的優(yōu)勢(shì)菌種為單形擬桿菌(Bacteroides uniformis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)、脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)和艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)等；干預(yù)后1周的優(yōu)勢(shì)菌種為單形擬桿菌、大腸桿菌、卵形擬桿菌、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)和艾克曼菌等；干預(yù)后1個(gè)月的優(yōu)勢(shì)菌種為脆弱擬桿菌、單形擬桿菌和艾克曼菌等。

2.2.3 腸道菌群多樣性

Alpha多樣性分析顯示，干預(yù)后1周時(shí)ace指數(shù)增高(P＜0.05)；1個(gè)月時(shí)observed species指數(shù)、chao指數(shù)和干預(yù)后指數(shù)較1周時(shí)降低，但仍高于入院時(shí)的數(shù)值；Shannon指數(shù)隨著干預(yù)時(shí)間逐漸增高，但無顯著性差異；Simpson指數(shù)在1周時(shí)最低(P＜0.05)。見圖3。

圖2 腸內(nèi)營養(yǎng)治療前后腸道菌群物種分析

2.3 炎癥因子

干預(yù)后1周時(shí)與入院時(shí)相比，ⅠL-1β增高(P＜0.05)，血清ⅠL-8逐漸下降(P＜0.05)；其他無顯著性差異(P ＞ 0.05)。1個(gè)月時(shí)與入院時(shí)相比，ⅠL-1β和ⅠL-6增高(P ＜ 0.05)，血清ⅠL-8逐漸下降(P ＜ 0.05)；ⅠL-1α和TNF-α無顯著性差異(P＞0.05)。見圖4。

3 討論

《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》[6]中指出，腦卒中后嘔吐和吞咽困難可引起脫水和營養(yǎng)不良，導(dǎo)致神經(jīng)功能恢復(fù)減慢。應(yīng)重視腦卒中后液體和營養(yǎng)狀況評(píng)估，必要時(shí)給予補(bǔ)液和營養(yǎng)支持?！?005年美國急性缺血性卒中早期治療指南》[7]中同樣推薦，對(duì)住院腦卒中患者應(yīng)進(jìn)行營養(yǎng)基線評(píng)定，并采取措施糾正或改善營養(yǎng)障礙。

本研究結(jié)果顯示，腸內(nèi)營養(yǎng)治療可能通過改變腸道微生態(tài)，調(diào)控炎癥因子水平，可能有利于促進(jìn)缺血性腦卒中患者的預(yù)后。

腦卒中后營養(yǎng)干預(yù)管理在我國腦卒中規(guī)范化康復(fù)中應(yīng)該引起重視。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過腸內(nèi)干預(yù)后1個(gè)月時(shí)，營養(yǎng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分下降，血漿總蛋白和白蛋白增高。

Beamer等[8]的研究顯示，腦卒中患者應(yīng)在入院后48 h內(nèi)進(jìn)行營養(yǎng)狀況篩查，任何患者存在營養(yǎng)不良或者進(jìn)食困難時(shí)都應(yīng)給予營養(yǎng)治療，可有利于神經(jīng)功能恢復(fù)?；颊呒覍傥桂B(yǎng)飲食內(nèi)容隨意，無法根據(jù)患者營養(yǎng)狀況及時(shí)供給，造成營養(yǎng)狀況持續(xù)惡化，可能會(huì)導(dǎo)致病情加重。

圖3 腸內(nèi)營養(yǎng)治療前后腸道菌群Alpha多樣性分析

圖4 營養(yǎng)治療前后血清炎癥因子的變化

本研究還發(fā)現(xiàn)，實(shí)施營養(yǎng)治療1周時(shí)，少數(shù)患者營養(yǎng)狀況有小幅度下降，提示腸內(nèi)營養(yǎng)可能并未完全達(dá)到營養(yǎng)需求目標(biāo)。Dávalos等[9]同樣發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦卒中患者中，早期營養(yǎng)治療1周后，發(fā)現(xiàn)其營養(yǎng)狀況并未明顯改善?？赡芘c腦卒中引起腦干和下丘腦功能紊亂，造成神經(jīng)內(nèi)分泌異常，以及腸黏膜屏障損害造成腸道吸收功能下降，導(dǎo)致營養(yǎng)攝入障礙等有關(guān)。這需要在以后的研究中進(jìn)一步探索。

采用16SrDNA基因序列分析檢測(cè)腸道菌群后發(fā)現(xiàn)，不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)OTU個(gè)數(shù)有變化，且從門水平和種水平上，菌群都有變化。

本研究結(jié)果顯示，干預(yù)1周時(shí)ace指數(shù)增高；1個(gè)月后observed species指數(shù)、chao指數(shù)和ace指數(shù)較1周時(shí)降低，但仍高于入院時(shí)數(shù)值，提示干預(yù)前后腸道菌群豐度存在差異；Shannon指數(shù)隨著干預(yù)時(shí)間逐漸增高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Simpson指數(shù)1周時(shí)最低，提示干預(yù)前后腸道菌群多樣性存在差異，說明腸內(nèi)營養(yǎng)治療可改變菌群的多樣性。也就是說，消化康復(fù)干預(yù)可以改變?nèi)毖阅X卒中患者腸道菌群的組成。Claesson等[10]同樣發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)治療可以改變腸道菌群豐度。

而Goyal等[11]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群多樣性和豐度不僅受飲食影響，還受年齡、性別、自身狀況、炎癥標(biāo)志物、糞便中代謝產(chǎn)物等多種因素影響。

Singh等[12]發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)的缺血性腦卒中動(dòng)物模型中，腸道菌群可以通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞來影響炎癥因子水平，從而影響腦卒中的預(yù)后。

Kostulas等[13]研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者ⅠL-8的增高趨勢(shì)，可能與ⅠL-8可趨化多形核白細(xì)胞聚集，加重腦細(xì)胞炎癥有關(guān)。臨床中也發(fā)現(xiàn)，患者血漿中ⅠL-1β和ⅠL-6有逐漸增高趨勢(shì)。多項(xiàng)研究認(rèn)為[13-15]，這種增高趨勢(shì)可能加速腦細(xì)胞損傷，延遲患者神經(jīng)功能恢復(fù)。

經(jīng)過腸內(nèi)營養(yǎng)治療，本研究中患者的ⅠL-8逐漸下降。提示營養(yǎng)治療可能通過免疫調(diào)節(jié)影響缺血性腦卒中的預(yù)后。

綜上所述，消化康復(fù)目前尚無明確的體系和具體的方案，通過研究腸道菌群，可為之提供理論依據(jù)。

本研究還需要從以下幾個(gè)方面改進(jìn)：①增加更多的觀察指標(biāo)，如功能評(píng)定量表等，進(jìn)一步研究腸道菌群干預(yù)與功能改善和預(yù)后的關(guān)系；②擴(kuò)大樣本量并延長隨訪時(shí)間；③消化康復(fù)是否需要采用腸內(nèi)與腸外營養(yǎng)相結(jié)合的方式，腸內(nèi)營養(yǎng)制劑的成分是否需要逐漸過渡等，仍需要進(jìn)一步研究。