組蛋白去乙?；敢种苿┡c加替沙星新綴合物的合成及抗腫瘤活性

楊科 王進 鄧艾平

(1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430014；2 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

近年來，以喹諾酮類藥物為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)來設(shè)計新型的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為腫瘤化學(xué)的一個熱門領(lǐng)域[1-3]。目前已有數(shù)百個具有抗腫瘤活性的喹諾酮衍生物被報道的[4-6]。通過研究喹諾酮類藥物的抗腫瘤機制發(fā)現(xiàn)，其主要通過抑制腫瘤細胞的拓撲異構(gòu)酶II與有絲分裂來起作用[7-8]。微管作為細胞的骨架在其有絲分裂過程中發(fā)揮著重要的作用，通過微管蛋白聚合抑制劑能夠破壞微管的結(jié)構(gòu)，使腫瘤細胞產(chǎn)生非正常的有絲分裂，從而造成腫瘤細胞的凋亡[9]。因此，設(shè)計出具有微管蛋白聚合抑制活性的喹諾酮衍生物將是喹諾酮類抗腫瘤藥物研究的一個新方向[10]。

組蛋白去乙?；?histone deacetylases,HDACs)是表觀遺傳中一個重要的酶家族，它調(diào)控著基因的轉(zhuǎn)錄和表達。當(dāng)HDACs呈現(xiàn)出過表達狀態(tài)時，將會打破基因的乙?；胶猓拐{(diào)控細胞周期和增殖的信號分子缺少表達，從而使得細胞惡變，引發(fā)腫瘤[11]。目前，HDACs，尤其是HDAC1、2、6，被發(fā)現(xiàn)過表達在多種癌細胞中[12-14]。因此，HDACs也成為了近年來腫瘤學(xué)研究的一類重要靶點。相應(yīng)地，已有多個HDAC抑制劑被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)了用于治療不同的癌癥[15]，例如伏立諾他(vorinostat,SAHA)能夠通過增加癌細胞中組蛋白乙?；絹碇匦录せ钜职┗?，最終實現(xiàn)腫瘤細胞的分化與凋亡[16]。

基于喹諾酮類藥物和HDACi展現(xiàn)出的優(yōu)秀抗腫瘤活性，最近本研究組以及其他研究組均發(fā)現(xiàn)將HDACi單元，即SAHA類似物通過酰胺(圖1，1A)[17]、酯(圖1，1B)[17]或者雜環(huán)(圖1，1C)[18]拼接到喹諾酮類藥物C-3位構(gòu)建出的喹諾酮-HDACi雙靶點綴合物不僅具有較強的HDACs靶向性，而且還展現(xiàn)出了優(yōu)秀的抗腫瘤活性。

近期的研究發(fā)現(xiàn)，喹諾酮類藥物C-3位羧基雖是抗菌活性的藥效團，但并非抗腫瘤活性是必須的，用其生物電子等排體或其他活性片段取代均能顯著地提高抗腫瘤活性[19-22]。然而，目前尚不了解喹諾酮類藥物C-7位堿性側(cè)鏈引入活性基團是否也能夠提高其抗腫瘤活性。因此，在前期研究的喹諾酮類藥物C-3位與HDACi(SAHA類似物)拼接的基礎(chǔ)上[17]，為了進一步探討喹諾酮類藥物C-7位拼接SAHA類似物對活性的影響，本研究擬將SAHA類似物通過點擊化學(xué)拼接到加替沙星(gatifloxacin,1)上構(gòu)建出新型加替沙星-HDACi綴合物(圖2,綴合物10a～c)；同時將SAHA類似物單元拼接在加替沙星(1)的C-3位作為對照物(圖2，綴合物13)；接著，測試這些綴合物的生物活性。結(jié)果表明，目標(biāo)綴合物對HDAC1、HDAC2和HDAC6均有不同程度的抑制活性，其中SAHA類似物單元拼接在加替沙星C-7位的綴合物10b與C-3位的13對HDACs的抑制活性、微管蛋白聚合抑制活性以及抗腫瘤活性影響相當(dāng)，即SAHA類似物單元的拼接位置對活性影響較小。所合成的4個目標(biāo)綴合物均未見文獻報道。

1 合成方法

目標(biāo)綴合物10a～c和13的合成過程見圖3。參照加替沙星(1)的合成方法[23]，以1-環(huán)丙基-6,7-二氟-4-氧代-1,4-二氫-喹啉-3-甲酸(3)為原料，將其喹諾酮母核與硼酸乙酯[B(OAc)3]鰲合得到鰲合物4，隨后再與哌嗪發(fā)生親核取代反應(yīng)得到了加替沙星鰲合物5；進一步將鰲合物5哌嗪基與炔丙基溴發(fā)生親核取代反應(yīng)得到乙炔基衍生物6。同時，通過親核取代反應(yīng)將溴代烷基酸2與疊氮鈉反應(yīng)制得烷基疊氮酸7；接著通過點擊化學(xué)將乙炔基化合物6與7反應(yīng)制得羧酸類綴合物8；然后用新配置的羥胺將羧酸類綴合物8的羧基轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的肟酸類綴合物9；最后將綴合物9水解即得到了加替沙星-HDACi綴合物10[圖3(i)]。

圖1 C-3 喹諾酮類藥物-HDACi 綴合物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of C-3 gatif l oxacin-HDACi conjugates

圖2 設(shè)計的加替沙星-HDACi 綴合物Fig.2 Design of dual-acting gatif l oxacin-HDACi conjugates

另一方面，C-3位加替沙星-HDACi綴合物13的合成路線如圖3(ii)所示。首先，將加替沙星(1)與炔丙胺反應(yīng)制成乙炔加替沙星11；接著通過點擊化學(xué)將乙炔加替沙星12與烷基疊氮酸7b反應(yīng)，制得加替沙星-HDACi羧酸類綴合物12；然后用新配置的羥胺將羧酸類綴合物12的羧基轉(zhuǎn)化成異羥肟酸，得到了相應(yīng)的肟酸類綴合物13。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

AM-400Hz型核磁共振儀(德國Bruker公司)；Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀(美國Coring公司)；細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；CKX31型倒置顯微鏡(Olympus公司)；SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)。

2.2 實驗試劑

1-環(huán)丙基-6,7-二氟代-8-甲氧基-1,4-二氫代-4-氧代喹啉基-3-羧酸、硼酸、2-甲基哌嗪、醋酸銅、氯甲酸乙酯、鹽酸羥胺、硫酸銅、L-抗壞血酸鈉、加替沙星、炔丙基溴、炔丙胺、TBTU、DIPEA、NaN3等試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑或百靈威科技有限公司(質(zhì)量分數(shù)≥95%)； HepG2、DU-145、MDA-MB-231、MCF-7細胞株購自武漢大學(xué)細胞典藏中心，MCF-10a細胞株購自中科院上海細胞典藏中心。

2.3 化學(xué)實驗步驟

2.3.1 1-環(huán)丙基-6,7-二氟代-8-甲氧基-1,4-二氫代-4-氧代喹啉-3-羧酸-O3,O4-二乙酸根合硼(4)的合成

在150mL的單口瓶中加入H3BO3(5.031g,81.2mmol)和Ac2O(40mL)，升溫至120℃，反應(yīng)2h后冷卻至70℃，加入化合物3(5.993g,20.3mmol)，升溫至120℃，繼續(xù)反應(yīng)7h，將反應(yīng)液冷卻至室溫，傾入150mL冰水中，用CH2Cl2(3×60mL)萃取，有機層用無水Na2SO4干燥，脫除溶劑，粗產(chǎn)品用乙醇重結(jié)晶得到8.421g白色固體，產(chǎn)率為97.8%，m.p.114～116℃(文獻值[23]：112～117℃)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ 9.19(s,1H),8.06(d,J=13.2Hz,1H),4.02～4.07(m,1H),3.79(s,3H,-OMe),2.01(s,6H,-OCOCH3),1.26～1.30(m,2H),1.18(t,J=6.4Hz,2H)。

2.3.2 1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-8-甲氧基-1,4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸-O3,O4-二乙酸根合硼(5)的合成

將化合物4(6.786g,16.0mmol)、2-甲基哌嗪(2.404g,24.0mmol)和Et3N(4.6mL)溶解到乙腈(30mL)中，室溫反應(yīng)12h，脫除溶劑，經(jīng)柱色譜純化(石油醚/乙酸乙酯=1:1,V/V)得到7.326g白色粉末，產(chǎn)率為90.8%,m.p.177～179℃。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ 9.17(s,1H),8.04(d,J=13.6Hz,1H),3.97～4.06(m,1H),3.76(s,3H,-OMe),3.37～3.43(m,3H),3.06～3.13(m,3H),3.01(d,J=6.4Hz,1H),1.98(s,6H,-OCOCH3),1.21～1.29(m,5H),1.15(t,J=6.8Hz,2H)。

圖3 加替沙星-組蛋白乙酰酶抑制劑綴合物的合成路線Fig.3 Synthetic route of gatif l oxacin-HDACi conjugates

2.3.3 1-環(huán)丙基-6-氟-7-(3-甲基-4-N-丙炔基-1-哌嗪基)-8-甲氧基-1,4-二氫-4-氧代喹啉-3-羧酸-O3,O4-二乙酸根合硼(6)的合成

氬氣保護下，將化合物5(5.863g,11.6mmol)、炔丙基溴(2.760g,23.2mmol)和碳酸氫鈉(1.949g,23.2mmol)用無水N,N-二甲基甲酰胺(30mL)溶解，在100℃下反應(yīng)48h，脫溶后粗產(chǎn)物用硅膠柱純化得到化合物6。白色固體，3.907g(62.1%),m.p.182～185℃;1H NMR(CDCl3,400MHz):δ9.18(s,1H),8.05(d,J=13.2Hz,1H),4.57(t,J=2.4Hz,1H),3.95～4.03(m,1H),3.74(s,3H,-OMe),3.32～3.41(m,3H),3.03～3.14(m,4H),2.42(t,J=2.8Hz,1H),1.24～1.31(m,5H),1.99(s,6H,-OCOCH3),1.17(t,J=7.2Hz,2H)。

2.3.4 疊氮烷基酸(7)的合成

按照文獻報道的方法[24]，以溴代烷基酸2和NaN3為原料制得疊氮烷基酸7。其中：5-疊氮戊酸(7a)，白色油狀物，產(chǎn)率91.7%;1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.35(t,J=6.4Hz,2H),2.46(t,J=6.8Hz,2H),1.71～1.86(m,2H),1.45～1.57(m,2H)。

6-疊氮己酸(7b)，白色油狀物，產(chǎn)率86.4%;1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.32～3.39(m,2H),2.42(t,J=7.2Hz,2H),1.72～1.89(m,2H),1.52～1.66(m,2H),1.33～1.44(m,2H)。

7-疊氮庚酸(7c)，白色油狀物，產(chǎn)率90.3%;1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.31(t,J=6.8Hz,2H),2.44(t,J=6.4Hz,2H),1.73～1.90(m,2H),1.58～1.69(m,2H),1.36～1.55(m,4H)。

2.3.5 羧酸類綴合物(8)的合成

氬氣保護下，將化合物6(1.302g,2.4mmol)、疊氮烷基酸7(3.6mmol)和醋酸銅(0.145g,0.8mmol)溶解到DMF(10mL)中，室溫下攪拌反應(yīng)48h后加入冰水(20mL)，用CH2Cl2(3×25mL)萃取，脫溶后粗產(chǎn)物用硅膠柱純化即得相應(yīng)的羧酸類綴合物8。其中：

8a(n=5)，白色粉末物，產(chǎn)率64.9%；1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.14(s,1H),8.02(d,J=13.6Hz,1H),7.71(t,J=4.4Hz,1H),4.49(t,J=7.2Hz,2H),3.96～4.03(m,1H),3.94(s,2H),3.78(s,3H,-OMe),3.32～3.39(m,3H),3.02～3.13(m,4H),2.43(t,J=6.8Hz,2H),2.06(s,6H,-OCOCH3),1.65～1.73(m,2H),1.62(t,J=6.8Hz,2H),1.21～1.39(m,9H),1.18(t,J=6.4Hz,2H)。

8b(n=6)，白色粉末物，產(chǎn)率69.2%；1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.17(s,1H),8.04(d,J=13.2Hz,1H),7.71(t,J=4.4Hz,1H),4.36(t,J=6.8Hz,2H),3.94～4.05(m,3H),3.76(s,3H,-OMe),3.31～3.38(m,3H),3.10(t,J=6.4Hz,1H),3.08(t,J=6.0Hz,2H),3.02(d,J=6.8Hz,1H),2.42～2.46(m,2H),2.07(s,6H,-OCOCH3),1.98(t,J=7.2Hz,2H),1.51～1.59(m,2H),1.23～1.38(m,9H),1.11～1.17(m,2H)。

8c(n=7)，白色粉末物，產(chǎn)率68.9%；1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.11(s,1H),8.07(d,J=13.6Hz,1H),7.75(t,J=4.8Hz,1H),4.43(t,J=6.8Hz,2H),4.01～4.07(m,1H),3.93(s,2H),3.77(s,3H,-OMe),3.31～3.39(m,3H),3.01～3.11(m,4H),2.42～2.48(m,2H),2.05(s,6H,-OCOCH3),1.99(t,J=6.8Hz,2H),1.56～1.64(m,2H),1.24～1.39(m,11H),1.14(t,J=6.4Hz,2H)。

2.3.6 C-7加替沙星-HDACi綴合物(10)的合成

按照文獻報道的方法[18]，以羧酸類綴合物8(1.1mmol)和氯甲酸乙酯(184mg,1.7mmol)為原料，在三乙胺(121mg,1.2mmol)的催化制得肟酸類綴合物10。

1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-8-甲氧基-7-(4-(N-羥基-6-(4-亞甲基-1,2,3-三氮唑基))-己酰胺)-3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸(10a,n=5)，白色粉末物，產(chǎn)率73.4%；1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.74(s,1H),8.49(s,1H),8.09(d,J=13.2Hz,1H),7.67(t,J=4.4Hz,1H),4.46(t,J=6.8Hz,2H),3.92(s,2H),3.71～3.79(m,4H),3.31～3.37(m,3H),3.06(t,J=6.4Hz,1H),2.93～2.99(m,2H),2.89(d,J=6.0Hz,1H),2.42(t,J=6.8Hz,2H),1.68～1.74(m,2H),1.65(t,J=6.4Hz,2H),1.34(t,J=6.8Hz,2H),1.24～1.31(m,7H),1.14(t,J=6.8Hz,2H);13C NMR(100MHz,Acetone-d6):δ 175.7(d,4JC-F=2.0Hz),173.2,171.8,155.4(d,1JC-F=252.6Hz),144.7(d,3JC-F=6.8Hz),141.9,144.1,131.3(d,2JC-F=24.5Hz),124.9(d,4JC-F=1.8Hz),124.4,123.6(d,3JC-F=8.4Hz),109.7,105.6(d,2JC-F=24.2Hz),63.3,57.2,55.9,54.8,51.9,51.2,50.5,41.2,30.7,29.7,28.8,25.2,15.8,9.0,8.9;HRMS(ESI)calcd for C28H37FN7O6[M+H]+,586.6351;found 586.6355。

1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-8-甲氧基-7-(4-(N-羥基-7-(4-亞甲基-1,2,3-三氮唑基))-庚酰胺)-3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸(10b,n=6)，白色粉末物，產(chǎn)率72.8%；1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.71(s,1H),8.47(s,1H),8.01(d,J=13.6Hz,1H),7.68(t,J=4.0Hz,1H),4.34(t,J=6.4Hz,2H),3.78(s,3H,-OMe),3.71～3.76(m,1H),3.95(s,2H),3.31～3.39(m,3H),3.11(t,J=6.8Hz,1H),2.98(t,J=6.4Hz,2H),2.92(d,J=6.4Hz,1H),2.41～2.46(m,2H),1.96(t,J=6.8Hz,2H),1.21～1.37(m,9H),1.52～1.59(m,2H),1.16(t,J=6.4Hz,2H);13C NMR(100MHz,Acetone-d6):δ 175.1(d,4JC-F=2.4Hz),174.5,172.2,155.7(d,1JC-F=253.4Hz),145.3(d,3JC-F=6.4Hz),144.5,130.8(d,2JC-F=24.8Hz),141.3,125.1(d,4JC-F=1.7Hz),124.2,123.1(d,3JC-F=8.0Hz),109.2,106.2(d,2JC-F=24.0Hz),63.8,57.6,56.2,54.5,52.4,51.6,50.9,41.8,33.9,31.5,31.2,26.1,20.7,15.3,9.2,8.9;HRMS(ESI)calcd for C29H39FN7O6[M+H]+,600.6617;found 600.6619。

1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-8-甲氧基-7-(4-(N-羥基-8-(4-亞甲基-1,2,3-三氮唑基))-辛酰胺)-3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉羧酸(10c,n=7),白色粉末物,產(chǎn)率77.1%;1H NMR(400MHz,Acetone-d6):δ 9.75(s,1H),8.52(s,1H),8.05(d,J=13.2Hz,1H),7.67(t,J=4.4Hz,1H),4.32(t,J=6.4Hz,2H),3.94(s,2H),3.78(s,3H,-OMe),3.70～3.76(m,1H),3.32～3.39(m,3H),3.04(t,J=6.4Hz,1H),2.92～2.98(m,3H),2.40～2.46(m,2H),1.94(t,J=6.8Hz,2H),1.55～1.62(m,2H),1.35(t,J=6.4Hz,2H),1.23～1.37(m,9H),1.18(t,J=6.4Hz,2H);13C NMR(100MHz,Acetone-d6):δ 174.9(d,4JC-F=2.2Hz),173.8,172.9,155.3(d,1JC-F=252.7Hz),144.9(d,3JC-F=6.0Hz),144.2,141.1,131.2(d,2JC-F=24.2Hz),125.7(d,4JC-F=2.8Hz),124.8,123.6(d,3JC-F=10.2Hz),109.5,106.7(d,2JC-F=24.3Hz),64.2,57.3,56.7,55.2,52.4,51.8,51.1,41.5,33.2,31.5,31.4,26.1,20.6,9.8,9.3,16.1;HRMS(ESI)calcd for C30H41FN7O6[M+H]+,614.6882;found 614.6887。

2.3.7 加替沙星乙炔酰胺(11)的合成

按照文獻報道的方法化合物11[24]，產(chǎn)率88.9%；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.85(s,1H),7.98(d,J=13.6Hz,1H),6.15(t,J=4.8Hz,2H),4.01～4.05(m,1H),3.77(s,3H,-OMe),3.32～3.41(m,3H),3.18(t,J=6.4Hz,1H),3.01～3.12(m,3H),2.19(t,J=2.4Hz,1H),1.27～1.35(m,2H),1.25(d,J=6.8Hz,3H,-Me),1.16(t,J=6.8Hz,2H)。

2.3.8 羧酸類加替沙星-HDACi(12)的合成

按照文獻報道的方法[24]，以化合物11和疊氮烷基酸7b為原料，在硫酸銅和L-抗壞血酸鈉的催化下制得12。白色固體，729 mg(69.4%)；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.65(s,1H),7.83(d,J=13.6Hz,1H),6.64(t,J=4.4Hz,1H),5.56(t,J=15.6Hz,2H),4.38(t,J=6.8Hz,2H),3.78(s,3H,-OMe),3.65～3.72(m,1H),3.30～3.37(m,3H),3.02～3.12(m,3H),2.95(d,J=6.8Hz,1H),2.39～2.46(m,2H),1.92(t,J=6.4Hz,2H),1.52～1.59(m,2H),1.22～1.37(m,9H),1.16(t,J=6.8Hz,2H)。

2.3.9 1-環(huán)丙基-6-氟-1,4-二氫-8-甲氧基-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-4-氧代-3-喹啉-3-((N-羥基-7-(1,2,3-三氮唑基))-庚酰胺基)甲酰胺(13)的合成

按照肟酸9的制備方法制得綴合物13，產(chǎn)率80.6%；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 9.67(s,1H),8.89(s,1H),8.61(s,1H),7.86(d,J=13.2Hz,1H),6.62(t,J=4.4Hz,1H),5.51(t,J=15.2Hz,2H),4.34(t,J=6.4Hz,2H),3.74(s,3H,-OMe),3.68～3.74(m,1H),3.31～3.39(m,3H),3.14(t,J=6.4Hz,1H),2.98(t,J=6.4Hz,2H),2.92(d,J=6.4Hz,1H),2.41～2.46(m,2H),1.99(t,J=6.8Hz,2H),1.49～1.55(m,2H),1.22～1.35(m,9H),1.18(t,J=6.4Hz,2H);13C NMR(100MHz,Acetone-d6):δ176.7(d,4JC-F=2.8Hz),174.2,171.1,122.5(d,3JC-F=8.4Hz),154.2(d,1JC-F=253.1Hz),146.7,144.1(d,3JC-F=7.8Hz),138.8 134.2(d,2JC-F=22.8Hz),124.8(d,4JC-F=2.2Hz),122.1,107.9,106.1(d,2JC-F=22.4Hz),63.3,53.4,52.4,51.4,47.0,45.6,43.5,40.9,32.5,31.9,30.4,28.2,25.6,15.5,9.1,8.9;HRMS(ESI)calcd for C29H40FN8O5[M+H]+,599.6769;found 599.6773。

2.4 HDACs抑制活性實驗

使用HDAC試劑盒測試合成的目標(biāo)化合物對HDAC1、2、6的抑制活性，以SAHA(N-羥基-N'-苯基-辛二酰胺)為陽性對照藥[7]。根據(jù)文獻報道的方法以及試劑盒說明書進行操作[25]，測定出每孔的熒光值，并計算出IC50，見表1。

2.5 微管蛋白聚合抑制實驗

使用Tubulin Polymerization Assay Kit測試加替沙星-HDACi綴合物抑制微管蛋白聚合的活性，將秋水仙堿(colchine)作為陽性對照。根據(jù)文獻報道的方法和試劑盒說明書進行操作[24]，最后在酶標(biāo)儀下測定熒光值(圖4)，并計算出IC50，見圖5。

2.6 體外抗增殖活性測試

選擇肝癌HepG2、前列腺癌PC-3和DU145細胞、乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7這5種腫瘤細胞，應(yīng)用MTT法對合成的綴合物進行體外抗腫瘤活性測試[26]，并計算出IC50，見表2。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成部分

加替沙星乙炔化合物6是通過親核取代反應(yīng)制備的，為了減少溴代丙炔與加替沙星C-3位羧酸也發(fā)生取代反應(yīng)，在合成目標(biāo)化合物時通過用硼酸乙酯將加替沙星的羧酸制成螯合物以減少副反應(yīng)的發(fā)生。

在合成加替沙星乙炔酰胺11是通過酰胺化反應(yīng)制備，我們采用了TBTU和DIPEA做為活化劑將加替沙星的羧基進行活化，制成相應(yīng)的加替沙星苯并三唑活性酯后，再與炔丙胺反應(yīng)制得加替沙星乙炔酰胺11，這樣提高了反應(yīng)的選擇性和中間體11的產(chǎn)率。

3.2 HDACs抑制活性

表1 目標(biāo)綴合物抑制HDAC1，HDAC2和 HDAC6的IC50值(±s,n=3)Tab.1 IC50 values of conjugates for inhibition of HDAC1,HDAC2 and HDAC6(±s,n=3)

表1 目標(biāo)綴合物抑制HDAC1，HDAC2和 HDAC6的IC50值(±s,n=3)Tab.1 IC50 values of conjugates for inhibition of HDAC1,HDAC2 and HDAC6(±s,n=3)

注：SAHA為N-羥基-N'-苯基-辛二酰胺

Compd.IC50/(mmol/L)Selectivity ratio HDAC1 HDAC2 HDAC6 HDAC1/6 HDAC2/6 10a 0.056±0.053 0.105±0.057 0.046±0.023 1.2 2.3 10b 0.032±0.018 0.078±0.014 0.021±0.007 1.5 3.7 10c 0.040±0.014 0.082±0.022 0.032±0.025 1.3 2.6 13 0.037±0.016 0.099±0.017 0.024±0.007 1.5 4.1 SAHA 0.044±0.007 0.016±0.008 0.039±0.004 1.1 0.4

圖4 微管蛋白在不同濃度綴合物10a(A)、10b(B)、10c(C)、13(D)、陽性藥物秋水仙堿(E)以及加替沙星(F)作用下的聚合-時間變化曲線Fig.4 Tubulin polymerization time-course plots following changes in A340 of reaction in the presence of increasing concentrations of 10a(A),10b(B),10c(C),13(D),colchine(E)and(F)

圖5 量效曲線計算綴合物的抑制微管蛋白聚合的IC50值Fig.5 Dose-response curves and derived IC50 value for 10a～c,13,colchicine and gatif l oxacin(AM-1155)in the tubulin polymerization assay

從表1中目標(biāo)綴合物對HDACs的抑制結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，將加HDACi單元拼接在加替沙星C-7位的側(cè)鏈上得到的綴合物10a～c對HDAC1、HDAC2和HDAC6均有較強的抑制活性，并對HDAC6的抑制活性強于HDAC1和HDAC2。但是，綴合物中SAHA單元的長度酶抑制活性影響較大，以6個亞甲基(n=6)的綴合物10b活性最佳，其抗HDACs活性與SAHA類似物單元拼接在加替沙星C-3位羧酸上的綴合物13相仿。但是，將綴合物10b疏水連接鏈長度進行縮短(10a,n=5)或延長(10a,n=7)均減弱HDACs的抑制活性。結(jié)果說明目標(biāo)綴合物對HDACs有較強的靶向性，對HDAC6有選擇性，其中SAHA類似物單元在加替沙星上C-3或C-7對HDACs抑制活性影響并不大。這可能是由于發(fā)揮抗HDACs活性主要來源于SAHA類似物單元，只要綴合物中含有SAHA類似物單元，均會發(fā)揮較強的HDACs抑制活性。

表2 目標(biāo)化合物對腫瘤細胞株的抗增殖活性(±s,n=3)Tab.2 Whole cell antiproliferative activity of target compounds(±s,n=3)

表2 目標(biāo)化合物對腫瘤細胞株的抗增殖活性(±s,n=3)Tab.2 Whole cell antiproliferative activity of target compounds(±s,n=3)

注：aIC50 not determinable up to highest concentrations tested

Compd.IC50/(μmol/L)HepG2 PC-3 9±0.81 8.6±0.46 1±0.45 4.5±0.39 8±0.37 6.2±0.24 DU-145 MDA-MB-231 MCF-7 MCF-10a 10a 7.7.2±0.62 6.5±0.36 5.9±0.84 ＞100a 10b 3.3.2±0.71 2.1±0.72 1.4±0.25 ＞100 10c 5.5.9±0.93 4.8±0.43 3.0±0.18 ＞100 13 4.5±0.31 4.1±0.27 5.1±0.55 2.8±0.82 1.6±0.47 ＞100 SAHA 3.8±0.23 4.9±0.26 3.7±0.39 3.4±0.42 4.4±0.39 8.6±0.49 Gatif l oxacin 78.5±7.64 89.3±8.21 71.4±6.39 74.9±8.34 69.9±7.88 ＞100

3.3 微管蛋白聚合抑制活性

目標(biāo)綴合物對微管蛋白抑制活性的結(jié)果見圖4～5。由圖4～5可見合成的4個綴合物均能顯著地抑制微管蛋白的聚合，其IC50值甚至與秋水仙堿相當(dāng)。這些結(jié)果表明所合成綴合物對微管蛋白也具有靶向性。此外，通過研究這些化合物的構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中的SAHA單元拼接在加替沙星位置對微管蛋白聚合影響較少，而SAHA單元中鏈長卻對抑制微管蛋白聚合影響較大，以6個亞甲基[10b,IC50=(2.1±0.87)mol/L]連接的活性最佳。

3.5 體外抗腫瘤活性

體外抗腫瘤的測試結(jié)果(表2)表明，4個綴合物對HepG2、PC-3、DU145、MDA-MB-231、 MCF-7均展現(xiàn)出了較強的抑制活性，并強于加替沙星(IC50＞69mol/L)；此外，在5種腫瘤細胞中，綴合物對MCF-7表現(xiàn)出了更強的抑制活性，其中化合物10b～c和13對MCF-7的抑制活性強于陽性藥物SAHA。這些結(jié)果表明，將SAHA單元引入到加替沙星中能增加其抗腫瘤活性。但是，SAHA類似物單元拼接在加替沙星位置對抗腫瘤活性影響并不大(綴合物10bvs13)，而綴合物中SAHA類似物單元的疏水連接鏈長度卻對抗腫瘤活性有較大的影響，也是以6個亞甲基[n=6,綴合物10b,IC50=(1.4±0.25)mol/L]連接的活性最佳，縮短[n=4,綴合物10a,IC50=(5.9±0.84)mol/L]或延長[n=7,綴合物10c,IC50=(3.0±0.18)mol/L]鏈長均降低抗腫瘤活性。

為了進一步評估綴合物的安全性，我們采用了MTT法測試了綴合物對正常的乳腺上皮細胞MCF-10a的毒性。表2的結(jié)果表明，所合成的綴合物毒性較低，但是陽性藥物SAHA卻表現(xiàn)出了一定的毒性。

綜上所述，利用點擊化學(xué)將SAHA類似物引入到加替沙星中能夠提高母體藥物的抗腫瘤活性，這對發(fā)展新型喹諾酮類抗腫瘤藥物具有一定的指導(dǎo)意義。