外源施加多胺對(duì)提高玉米種子耐冷性的研究

王 成 李月明 郝 楠 白 添

（1 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，沈陽(yáng)110161；2 遼寧省東北育才超常教育實(shí)驗(yàn)部，沈陽(yáng)110161）

玉米是溫度敏感性作物，在種子吸脹期間如遇低溫，極易發(fā)生吸脹冷害，造成后期成苗率顯著下降，使玉米大幅減產(chǎn)[1]。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量的氧自由基，細(xì)胞膜透性增大，造成氧化脅迫傷害[2]。多胺被認(rèn)為是植物體內(nèi)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，是一類(lèi)具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿的總稱(chēng)，最常見(jiàn)的包括精胺（Spm，spermine）、亞精胺（Spd，spermidine）和腐胺（Put，putrescine），具有調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫尤其是減少氧化脅迫傷害等作用[3-6]。Kamiab 等[7]研究表明，當(dāng)植物幼苗遭遇鹽脅迫時(shí)外源施加多胺能有效提高其抗性；當(dāng)植物遭遇水脅迫時(shí)，生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)明顯受到抑制，而Duan 等[8]的研究結(jié)果顯示外源施加多胺能有效緩解水脅迫抑制作用。在玉米中的研究表明，葉面噴施外源多胺能顯著提高夏玉米灌漿前期抗?jié)承訹9]；當(dāng)玉米幼苗遭受鎘（Cd，Cadmium）脅迫時(shí)，多胺也能顯著促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，降低脅迫傷害[10]；崔寶明[11]研究認(rèn)為外源多胺可在一定程度上促進(jìn)玉米幼苗的再生，增加株高、葉長(zhǎng)、葉寬、鮮重，并提高其根系活力。

種子的萌發(fā)是由種子活力和外界環(huán)境因素共同決定的，而非生物脅迫是限制種子萌發(fā)的重要因素。引發(fā)劑是一類(lèi)化學(xué)物質(zhì)，而通過(guò)種子引發(fā)等化學(xué)調(diào)控方法能有效增強(qiáng)植物溫度逆境耐性[12]。目前關(guān)于低溫對(duì)玉米種子萌發(fā)的研究較多，但大多集中在對(duì)發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和活力指數(shù)等形態(tài)指標(biāo)的研究上，而對(duì)外源引發(fā)劑施用對(duì)玉米種胚生理生化和萌發(fā)特性調(diào)控機(jī)制的研究較少。基于此，本研究以對(duì)低溫敏感性不同的遼寧地區(qū)骨干自交系為研究材料，研究在低溫脅迫下，外源施加Spm 和Spd 對(duì)玉米種子萌發(fā)、苗期生長(zhǎng)和抗氧化酶活性等指標(biāo)的影響，分析多胺施用與低溫脅迫之間的關(guān)系，探討利用外源多胺緩解玉米種子低溫脅迫的相關(guān)機(jī)制，以期為種子引發(fā)技術(shù)在玉米生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 供試材料為本實(shí)驗(yàn)室前期篩選的玉米耐冷自交系遼2386 和冷敏感自交系遼6082。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，4 次重復(fù)。

1.2.1 種子引發(fā)處理 在墊有兩層濾紙發(fā)芽盒中均勻排列50 粒玉米種子，加入Spm（0.25mmol/L）、Spd（0.25mmol/L）溶液各10mL 和NaClO（0.3%）溶液1mL，在15℃黑暗條件下引發(fā)72h。引發(fā)結(jié)束后，將種子用蒸餾水快速?zèng)_洗3 次，吸干表面水分，于25℃陰涼通風(fēng)處放置3d。對(duì)照為經(jīng)NaClO （0.3%）溶液消毒10min 而未引發(fā)的種子。

1.2.2 種子低溫吸脹發(fā)芽 采用人工模擬低溫的試驗(yàn)，將2 個(gè)玉米自交系種子在5℃黑暗條件下蒸餾水低溫吸脹48h 后，按照GB/T3543.4-1995 標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)規(guī)程[13]，采用沙盤(pán)培養(yǎng)法在25℃（光照12h/d）的恒溫培養(yǎng)箱（三洋MLR-351H）進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法 調(diào)查發(fā)芽7d 后玉米種子的發(fā)芽數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽率，測(cè)定苗長(zhǎng)、根長(zhǎng)、苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重等性狀指標(biāo)。

發(fā)芽率=發(fā)芽試驗(yàn)?zāi)┢谝?guī)定日期內(nèi)正常的發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

玉米種子在5℃低溫黑暗條件下分別吸脹0h、12h、24h、36h 和48h 后，手工剝離種胚，測(cè)定丙二醛（MDA）含量和過(guò)氧化歧化酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性，3 次重復(fù)。MDA 含量測(cè)定采用硫代巴比妥（TBA）顯色反應(yīng)法，POD 活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，SOD 活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原法，具體參照張蜀秋[14]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010 和SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多胺引發(fā)對(duì)玉米種子發(fā)芽和苗期生物量的影響 耐冷自交系遼2386 低溫吸脹后發(fā)芽率為90%，冷敏感自交系遼6082 低溫吸脹后發(fā)芽率僅為83%。種子經(jīng)多胺引發(fā)后，遼2386 的發(fā)芽率為91%，和引發(fā)前差異不顯著，而遼6082 發(fā)芽率為93%，和引發(fā)前相比顯著提高了12%（圖1A）。玉米苗期生物量測(cè)定結(jié)果顯示：種子經(jīng)多胺引發(fā)后，不同自交系苗期表型差異較大（圖1B）。遼2386 苗高和根長(zhǎng)分別為6.88±1.13cm 和10.06±1.04cm，和未引發(fā)種子相比，苗高差異不顯著，而根長(zhǎng)顯著降低了29.08%；遼6082 苗高和根長(zhǎng)分別為9.28±0.37cm和10.07±0.26cm，和未引發(fā)種子相比，根長(zhǎng)差異不顯著，而苗高顯著提高了44.62%（圖1C 和D）。對(duì)苗鮮重、根鮮重、苗干重和根干重等指標(biāo)進(jìn)行分析，遼6082 種子經(jīng)多胺引發(fā)后苗鮮重顯著提高了26.76%（圖1E），其他指標(biāo)差異不顯著（圖1F～H）。結(jié)果表明，玉米不同自交系及不同器官對(duì)多胺敏感性不同，施加該濃度的多胺引發(fā)劑對(duì)低溫條件下冷敏感自交系種子生長(zhǎng)和發(fā)育具有很好的促進(jìn)作用。

2.2 低溫吸脹期玉米胚中MDA 含量和抗氧化酶活性的變化 對(duì)胚中MDA 含量進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)，遼2386 多胺引發(fā)前后胚中的MDA 含量大體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，而遼6082 大體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。未經(jīng)引發(fā)處理的遼6082 種胚中的MDA 含量在0h、12h、24h 和48h 4 個(gè)吸脹時(shí)期均高于遼2386，并分別在24h 和36h 先后達(dá)到峰值。兩自交系種子經(jīng)多胺引發(fā)后，胚中MDA 含量均顯著降低，且遼6082 在大部分吸脹時(shí)期均高于遼2386（圖2A）。

圖1 多胺引發(fā)對(duì)玉米種子低溫吸脹后發(fā)芽率和苗期生物量的影響

對(duì)胚中SOD 活性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)，遼2386 和遼6082 多胺引發(fā)前后胚中的SOD 活性大體上呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。遼2386 未經(jīng)引發(fā)處理的胚中SOD 活性高于遼6082。經(jīng)多胺引發(fā)后，遼2386 胚中SOD 活性在吸脹前期顯著升高且在12h 達(dá)到高峰后又逐漸下降，而遼6082 胚中SOD 活性在大部分吸脹時(shí)期均顯著升高，且在36h 達(dá)到高峰（圖2B）。

對(duì)胚中POD 活性進(jìn)行分析結(jié)果顯示，隨著5℃低溫吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)，POD 活性大體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，未經(jīng)引發(fā)處理的遼2386 胚中的POD 活性在大部分吸脹時(shí)期均高于遼6082，經(jīng)多胺引發(fā)后，POD活性均顯著提高，遼6082 提高幅度更大且在36h 達(dá)到高峰（圖2C）。

圖2 低溫吸脹下胚中MDA 含量以及SOD 和POD 活性

3 結(jié)論與討論

吸脹冷害是指種子在低溫下進(jìn)行吸脹產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致種子活力下降，影響種子的田間出苗率和幼苗的正常生長(zhǎng)發(fā)育[15]。玉米種子萌發(fā)的最適溫度一般是24～31℃，低溫對(duì)種子活力指標(biāo)有顯著的抑制作用。不同的玉米自交系對(duì)溫度敏感性差異較大，在本試驗(yàn)中，種子在5℃黑暗條件下低溫吸脹48h后，冷敏感自交系遼6082 發(fā)芽率顯著低于遼2386，在種子吸脹中的低溫脅迫期，從MDA 含量和POD、SOD 的活性測(cè)定分析結(jié)果中也可以看出，遼2386的膜脂過(guò)氧化程度較輕，而對(duì)氧自由基的清除能力和對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性強(qiáng)于遼6082。說(shuō)明不同基因型玉米對(duì)低溫的耐受性存在顯著差異，這與前人研究結(jié)果[16]相一致。

目前，對(duì)冷害機(jī)制研究較多，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為冷害對(duì)植物的傷害主要表現(xiàn)為膜損傷而引起的內(nèi)部代謝紊亂。正常情況下，生物膜保持一定的流動(dòng)性，當(dāng)遭遇冷害時(shí)，冷敏感植物的膜緊密收縮，使膜透性增大，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的溶質(zhì)外滲，同時(shí)酶系統(tǒng)遭受破壞，酶活性降低，嚴(yán)重時(shí)發(fā)生冷害死亡。而一些植物的膜系統(tǒng)修復(fù)能力較強(qiáng)，同時(shí)能夠及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，提高低溫逆境的適應(yīng)性[17]。MDA 為膜脂過(guò)氧化過(guò)程中，活性氧攻擊細(xì)胞膜上的膜脂而產(chǎn)生，因此MDA 含量是逆境生理研究中的一個(gè)標(biāo)志膜脂過(guò)氧化程度的重要生理指標(biāo)，而POD 和SOD 能夠通過(guò)化學(xué)反應(yīng)清除植物體內(nèi)的氧自由基，保護(hù)植物細(xì)胞。一般認(rèn)為，植物內(nèi)部的POD、SOD 活性與種子對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性呈正相關(guān)，而MDA 含量與種子對(duì)低溫逆境的適應(yīng)性呈負(fù)相關(guān)[18]，這與本研究所得結(jié)果相一致。

種子引發(fā)技術(shù)已被應(yīng)用到不同植物種子生產(chǎn)實(shí)踐中，引發(fā)后的種子出苗率高且整齊，苗期抗逆性好[19-21]，但國(guó)內(nèi)玉米種子引發(fā)劑篩選研究較少。左冰云等[22]研究表明以外源赤霉素（GA）作為引發(fā)劑對(duì)玉米種子進(jìn)行處理可顯著提高玉米葉片的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、單株葉面積、干物質(zhì)積累量、光合色素含量以及百粒重和籽粒產(chǎn)量。王莉等[23]以GA 和KCl 作為引發(fā)劑對(duì)玉米種子進(jìn)行處理，結(jié)果表明引發(fā)劑可不同程度增強(qiáng)種子活力、提高發(fā)芽質(zhì)量以及增強(qiáng)耐鹽性。杜錦等[24]研究表明玉米種子經(jīng)NaCl 溶液引發(fā)處理后，出苗率和苗期生物量均顯著增加。以上研究篩選出了多種適宜玉米種子萌發(fā)的引發(fā)劑，為引發(fā)劑在玉米種子生產(chǎn)應(yīng)用中奠定了基礎(chǔ)。而多胺作為引發(fā)劑的研究較少，張彥萍[25]研究結(jié)果證明多胺引發(fā)能夠提高茄子種子活力及幼苗抗冷性。本研究主要是以低溫敏感性不同的玉米作為材料，研究結(jié)果表明多胺引發(fā)劑Spd 和Spm 引發(fā)能有效提高吸脹中低溫脅迫下種子的抗氧化能力和發(fā)芽能力，結(jié)合前人研究結(jié)果推測(cè)，多胺能夠提高植物抗冷性的可能原因主要是多胺是一類(lèi)具有生物活性的低分子量脂肪族含氮堿，可以以多聚陽(yáng)離子的方式存在，同時(shí)可以結(jié)合帶負(fù)電荷的核酸以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)，從而激活一系列表達(dá)調(diào)控反應(yīng)，調(diào)節(jié)抗氧化酶SOD 和POD 等活性，從而使植物產(chǎn)生抗冷性[26-27]。因此，外源多胺引發(fā)處理這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用將對(duì)提高早春低溫播種條件下玉米出苗率和成苗率具有重要的意義。