冷卻治療對勞力性熱射病大鼠下丘腦AVPmRNA表達及蛋白表達的影響

劉秀珍，彭慶文 ，張 冰，王蘊紅

自2008年北京奧運會以來，伴隨全民健身熱潮的急劇升溫，馬拉松運動逐漸成為健身新時尚，已經(jīng)發(fā)展成為國內(nèi)外辦賽最多、參賽人員規(guī)模最大的賽事項目。但是馬拉松運動也是一項高風險的耐力項目，跑馬選手在比賽中猝死的事故頻發(fā)。國外研究發(fā)現(xiàn)，在馬拉松等耐力性項目比賽中，運動員發(fā)生猝死的2個重要原因是心律失常和勞力性熱射病，并且勞力性熱射病死亡比心律失常死亡更為普遍[1]。國內(nèi)研究表明，在馬拉松等耐力性項目比賽中，發(fā)生猝死的運動員均為既往體健，且多有運動習慣者，因此，跑馬拉松死亡的原因并不能簡單用體質(zhì)好壞或有無運動鍛煉習慣來衡量，運動誘發(fā)勞力性熱射病是馬拉松等耐力運動員發(fā)生猝死的重要原因[2-3]。勞力性熱射病（Exertional heat stroke，EHS）是一種以核心溫度超過40.5℃和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙為特征的致命性疾病[4]，它對運動員生命安全造成極大的挑戰(zhàn)，是運動員發(fā)生猝死的最常見原因[5]。由于其發(fā)病急，病情進展快，30 min內(nèi)沒有得到快速降溫處理的患者發(fā)生多器官功能衰竭以及死亡的機率會顯著性增加[6]。因此，必須在運動現(xiàn)場對患者進行快速冷卻，以確?；颊叽婊?。

勞力性熱射病患者除了出現(xiàn)體溫過高以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙外，還會發(fā)生脫水、電解質(zhì)紊亂、橫紋肌溶解、急性腎衰竭、急性肝損傷、急性胃腸炎、鐮狀細胞特征、心律失常等多器官功能障礙[7]。其病理生理學機制涉及胃腸道炎癥變化、凝血功能異常、熱交換損傷、熱休克反應、水鹽代謝失衡等方面，其中水鹽代謝失衡與體溫調(diào)節(jié)密切相關。目前，國際上針對熱射病進行冷卻治療的研究主要集中在冷療方法、冷療預案、過冷危險等。其作用機制主要涉及替代性行使心血管體溫維護、抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)熱損傷、減緩全身炎癥反應和阻斷多器官功能障礙等方面。但是迄今為止，尚無冷卻治療對熱射病患者水鹽代謝調(diào)節(jié)方面的直接探索，冷卻治療通過水鹽代謝糾正水平衡和電解質(zhì)紊亂，進而恢復體溫調(diào)節(jié)的病理生理學機制仍不十分清楚。冷卻治療在降溫的過程中，是否通過改變下丘腦抗利尿激素的合成與分泌來改善水代謝，進而通過抗脫水途徑恢復下丘腦體溫調(diào)控作用并促進熱射病病情轉(zhuǎn)歸的病理生理學機制需要進一步研究。因此，本文針對勞力性熱射病大鼠冷卻治療中下丘腦抗利尿激素AVPmRNA表達及蛋白表達的的變化進行研究，明確抗利尿激素在水代謝穩(wěn)態(tài)中的作用，為今后研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

51只7周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，初始體重為（237.22±31.86）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011] 。大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲水攝食，光照比為12 h：12 h，室內(nèi)溫度20～25℃，濕度45%～50%。大鼠適應性喂養(yǎng)1天，隨機分為6組，常溫對照組（NC，n=8）、高溫運動即刻組（HE，n=9）、高溫運動休息1組（HER1，n=9）、高溫運動冷浸1組（HEC1，n=8）、高溫運動休息2組（HER2，n=9）、高溫運動冷浸2組（HEC2，n=8）。

1.2 實驗動物模型制備

1.2.1 適應性訓練 高溫運動組大鼠進行為期5天的適應性訓練。跑臺坡度設置為0。訓練強度為起始運動速度18 m/min，每天遞增2 m/min，最后達到26 m/min。訓練時間為起始運動時間30 min，每天遞增10 min，最后達到60 min。適應性訓練安排見表1。

表1 大鼠適應性訓練安排Table1 Adaptive Training Arrangement in Rats

1.2.2 高溫運動實驗 大鼠適應性訓練后休息3天，再進行一次性高溫力竭運動。高溫運動實驗在環(huán)境密閉的高溫高濕實驗室內(nèi)進行，高溫高濕溫度控制為（36±1）℃，濕度控制為75%±5%。大鼠運動強度根據(jù)Bedford最大攝氧量表[8]及大鼠高溫運動預實驗，確定大鼠跑臺坡度為5度，速度為28 m/min，相當于最大攝氧量60%～80%的運動強度。大鼠熱射病診斷標準根據(jù)：（1）BOUCHAMA[9]經(jīng)典型熱射病狒狒模型：當高溫應激動物直腸溫度上升到42.5℃標志發(fā)生中度熱射病或動脈收縮壓下降到90 mmHg以下即出現(xiàn)低血壓標志發(fā)生重度熱射?。唬?）LAM[10]經(jīng)典型熱射病大鼠模型：當高溫應激動物直腸溫度上升到約42℃和平均動脈壓從峰值下降到約25 mmHg標志發(fā)生熱射??；（3）CHANG[11]熱運動至力竭誘導勞力性熱射病大鼠模型及勞力性熱射病大鼠建模預實驗，確定勞力性熱射病大鼠模型為大鼠進行熱運動至力竭，并使直腸溫度上升到約42℃。力竭標準為大鼠不能維持預定運動強度，滯留于跑臺后擋板，使用聲、電刺激及毛刷連續(xù)驅(qū)趕3次無效。大鼠運動至力竭后，快速測定直腸溫度并做記錄。

1.2.3 冷水浸泡實驗 大鼠冷水浸泡方案根據(jù)：（1）MCDERMOTT[12]治療熱射病常用冷卻方式的冷卻速率；（2）RIANA[4]海軍陸戰(zhàn)隊馬拉松運動員勞力性熱射病冷卻措施；（3）STEWART[13]勞力性熱射病患者冷卻案例及大鼠冷水浸泡預實驗確定。本實驗冷水浸泡溫度設定為19℃，實際溫度變化范圍為18～20℃。冷水浸泡時間設定為5 min。冷浸過程中大鼠如出現(xiàn)顫抖，應考慮立即停止冷浸，并防止過冷。休息溫度設定為20℃，實際溫度變化范圍為19～21℃。在高溫運動至力竭后，HER1組大鼠休息5 min；HEC1組大鼠冷浸5 min；HER2組大鼠休息65 min（5 min+60 min）；HEC2組大鼠冷浸5 min，休息60 min。在60 min休息期間，每間隔10 min監(jiān)測一次大鼠直腸溫度。

1.3 取材及處理

各組大鼠實驗結(jié)束后，立即采用10%水合氯醛按照0.32 mL/100 g體重的劑量對大鼠進行腹腔麻醉。冰上解剖大鼠，選取腹主動脈進行取血；摘取下丘腦后立即放入液氮中迅速冷凍及保存。

1.4 測試指標與方法

1.4.1 血常規(guī) 采用日本光電工業(yè)株式會社全自動血細胞分析儀（MEK-7222K，Japan）測試大鼠血常規(guī)，選取紅細胞壓積（Hematocrit，Hct）與血紅蛋白（hemoglobin，Hb）指標進行研究。試劑由上海東湖生物醫(yī)學有限公司提供。

1.4.2 血激素 采用美國ThermoMK3酶標儀（MK3，America）測試大鼠血液抗利尿激素（Arginine Vasopressin，AVP），測試方法為雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。大鼠抗利尿激素ELISA試劑盒由美國Enzolife公司提供。

1.4.3 RNA的提取和qRT-PCR檢測 采用熒光定量qRTPCR檢測系統(tǒng)測試下丘腦AVPmRNA表達。取適量組織放入液氮預冷的研缽中研磨成粉末并轉(zhuǎn)移到EP管中，用Trizol（美國Invitrogen公司）試劑抽提總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中查找的相關基因序列設計的特異性引物（見表2），采用EvaGreen飽和染料Mix進行實時熒光定量qRT-PCR檢測（見圖1）[14]。根據(jù)各反應孔的△CT值，運用2-△△CT相對定量法計算目的基因的相對表達量。用內(nèi)參GAPDH對其進行標準化。1.4.4 蛋白的提取和Western Blot檢測 （1）蛋白抽提：預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑（cocktail）；12 000 rpm（4度）離心15 min。取上清，進行蛋白定量。

表2 實時熒光定量PCR引物信息Table2 The List of Primer in qRT-PCR

圖1 EvaGreen核酸染料經(jīng)由釋放點播機制結(jié)合到雙鏈DNAFigure1 EvaGreen Nucleic Acid Dyes are Linked to Double Stranded DNA Via Release-on-demand Mechanism

（2）BCA法蛋白定量：按照BCA蛋白定量試劑盒使用說明操作，測定蛋白濃度。

（3）Western Blot：將樣本分別加入凝膠孔中，30 ug/孔。采用濃縮膠恒壓電泳：90 V，約20 min；分離膠恒壓150 V，通過預染蛋白marker來確定電泳停止時間。采用濕式轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，60 min。5%BSA-TBST室溫封閉，水平搖床孵育1 h。一抗孵育：5%BSA-TBST稀釋一抗（AVP，1：2 000；GAPDH，1：1 000，Abcam公司），4℃水平搖床孵育過夜。次日，TBST洗膜：3×10 min。二抗孵育：5%BSA-TBST稀釋二抗（山羊抗兔IgG（H+L），HRP，1：10 000，Abcam公司），室溫孵育1 h。TBST洗膜：3×10 min。將ECL發(fā)光液滴加到膜的蛋白面，反應3～5 min。膠片曝光：10 s～5 min（曝光時間隨不同光強度而調(diào)整），顯影2 min，定影。

（4）計算結(jié)果：采用Image J軟件計算蛋白條帶灰度值，Western Blot結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值的比值表示。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，結(jié)果以均值±標準差（M±SD）表示。組間比較采用獨立樣本非參數(shù)檢驗（Mann-Whitney U檢驗）方法。采用相關樣本非參數(shù)檢驗（Wilcoxon帶符號秩檢驗）分析高溫運動各組大鼠運動前后直腸溫度。P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的體重與運動時間

高溫運動前，6組大鼠體重無顯著性差異（P＞0.05）（見圖2a）；進行高溫運動的5組大鼠運動時間無顯著性差異（P＞0.05）（見圖2b）。

圖2 各組大鼠的體重與運動時間Figure2 Body Weight and Exercise Duration of Rats in Each Group

2.2 各組大鼠的體溫及冷卻速率

與NC組相比，經(jīng)過適應訓練的HE組大鼠在高溫運動前體溫顯著升高（P＜0.05）；但是HE組大鼠與其他4組經(jīng)過適應訓練的大鼠（HER1，HEC1，HER2，HEC2）在高溫運動前體溫進行兩兩比較并無顯著性差異。與運動前體溫自身對照，HE組與HEC2組大鼠體溫在高溫運動后顯著升高（P＜0.05）；HER1組與HER2組大鼠體溫在高溫運動后非常顯著升高（P＜0.01）；HEC1組大鼠運動后體溫無顯著性差異（P＞0.05），這是因為這組大鼠中有一只大鼠運動后體溫出現(xiàn)了異常值（39.85℃），沒有足夠的理由剔除它，但是如果去掉這個異常值，運動后體溫跟運動前體溫有顯著差異（P＜0.05）。高溫運動大鼠各組間體溫上升無顯著性差異（P＞0.05）。與HER1組相比，HEC1組大鼠體溫在運動前、運動后及上升值方面均無顯著性差異，但是冷浸5 min后的體溫非常顯著降低（P＜0.01）；與HER2組相比，HEC2組大鼠體溫在運動前、運動后及上升值方面均無顯著性差異，但是冷浸5 min后的體溫非常顯著降低（P＜0.01）。在20℃環(huán)境中休息60 min期間，HER2組和HEC2組大鼠體溫均持續(xù)下降，二者分別在休息30 min和休息20 min時降到最低值，隨后體溫均開始回升；每間隔10 min的HEC2組大鼠體溫均顯著低于HER2組大鼠體溫（P＜0.05）。參加冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠冷卻速率分別為（1.15±0.24）℃/min和（1.10±0.26）℃/min，二者無顯著性差異（P＞0.05）（見表3）。

表3 各組大鼠的體溫及冷卻速率Table3 Core Body Temperature and Cooling Rate of Rats in Each Group

2.3 各組大鼠的紅細胞壓積與血紅蛋白

與NC組相比，HE組大鼠紅細胞壓積顯著升高（P＜0.05）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、，HER2組、HEC2組大鼠紅細胞壓積無顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠紅細胞壓積無顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠紅細胞壓積無顯著性差異（P＞0.05）（見圖3a）。與NC組相比，HE組大鼠血紅蛋白無顯著性差異（P＞0.05）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、HER2組、HEC2組大鼠血紅蛋白無顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠血紅蛋白無顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠血紅蛋白無顯著性差異（P＞0.05）（見圖3b）。

圖3 各組大鼠的紅細胞壓積與血紅蛋白Figure3 Hematocrit and Hemoglobin of Rats in Each Group

2.4 各組大鼠的血液抗利尿激素

與NC組相比，HE組大鼠血液抗利尿激素非常顯著升高（P＜0.01）；與HE組相比，HER1組、HEC1組、HER2組、HEC2組大鼠血液抗利尿激素無顯著性差異（P＞0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠血液抗利尿激素無顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠血液抗利尿激素無顯著性差異（P＞0.05）（見圖4）。

圖4 各組大鼠的抗利尿激素Figure4 Arginine Vasopressin of Rats in Each Group

2.5 各組大鼠下丘腦AVPmRNA表達

與NC組相比，HE組大鼠下丘腦AVPmRNA表達非常顯著上調(diào)（P＜0.01）；與HE組相比，常溫休息HER1組和HER2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達無顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達非常顯著下調(diào)（P＜0.01）；與休息HER1組相比，冷浸HEC1組大鼠下丘腦AVPmRNA表達非常顯著下調(diào)（P＜0.01）；與HER2組相比，HEC2組大鼠下丘腦AVPmRNA表達無顯著性差異（P＞0.05）（見圖5）。

圖5RNA電泳和qRT-PCR結(jié)果Figure5 RNA Electrophorogram and qRT-PCR Results

2.6 各組大鼠下丘腦AVP蛋白表達

與NC組相比，HE組大鼠下丘腦AVP蛋白表達非常顯著性上調(diào)（P＜0.01）；與HE組相比，常溫休息HER1組和HER2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05），經(jīng)過冷浸的HEC1組和HEC2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達均顯著下調(diào)（P＜0.05）；與HER1組相比，HEC1組大鼠下丘腦AVP蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）；與HER2組相比，HEC2組大鼠下丘腦AVP蛋白表達無顯著性差異（P＞0.05）（見圖6）。

圖6 Western Blot結(jié)果Figure6 The Results of Western Blot

3 分析與討論

3.1 運動及冷療對大鼠體溫的影響

ZHANG[15]建立了勞力性熱射病大鼠模型，用于研究紅景天苷對線粒體的保護作用，大鼠在建模前并未進行適應性訓練。為了研究肝素對勞力性熱射病大鼠模型早期干預的作用，陳潔坤[16]建立了勞力性熱射病大鼠模型，所有大鼠先經(jīng)過6天適應性訓練后再進行分組，適應性訓練是否會引起大鼠體溫變化未見報道。與前人的研究有所不同，本研究中的常溫對照組（NC）未經(jīng)過適應性訓練，而5個高溫運動組（HE，HER1，HEC1，HER2，HEC2）大鼠均參加了適應性訓練。高溫運動前，HE組大鼠體溫顯著高于NC組大鼠體溫，但是與其他4組大鼠體溫相互之間并無顯著性差異，提示適應性訓練也會引起大鼠體溫上升。

實驗室熱射病動物模型包括狒狒模型，大鼠模型，小鼠模型等。鑒于非人類靈長類動物（如狒狒）體溫調(diào)節(jié)反應比任何其他物種更能匹配人類的體溫調(diào)節(jié)反應，BOUCHAMA[9]在44～47℃的熱應激中建立了經(jīng)典型熱射病狒狒模型并進行了炎癥、止血及臨床變化的研究，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典型熱射病狒狒模型中，動脈收縮壓下降到90 mmHg以下即體溫上升到（43.3±0.1）℃的重度熱射病狒狒在145～265 min內(nèi)全部死亡；體溫上升到（42.5±0.0）℃的中度熱射病狒狒全部存活，但均表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)障礙。LAM[10]建立了經(jīng)典型熱射病大鼠模型，用于研究3-（5′-羥甲基-2′-呋喃基）-1-芐基吲唑（YC-1）在治療熱射病大鼠中熱休克蛋白HSP70所起到的保護性作用，發(fā)現(xiàn)在42℃熱應激中建立的體溫在42.0℃左右的熱射病大鼠模型的體溫顯著高于對照組。為了研究多器官損傷的生物標志，KING[17]在37.5、38.5、和39.5℃3種熱環(huán)境中通過轉(zhuǎn)輪運動建立了勞力性熱射病小鼠模型，建模標準為小鼠熱運動至出現(xiàn)限制性神經(jīng)癥狀（意識喪失），研究發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)限制性神經(jīng)癥狀（意識喪失）時所能達到的最高核心溫度為42.1～42.5℃。CHANG[11]的研究發(fā)現(xiàn)在36℃環(huán)境下熱運動至力竭時，大鼠出現(xiàn)勞力性熱射病癥狀包括體溫過高、嚴重低血壓、神經(jīng)功能障礙和腦損傷。與BOUCHAMA建立的中度熱射病狒狒模型標準有所不同，本研究中高溫運動至力竭的5組大鼠運動后體溫并未上升到42.5℃；但是由于其運動后體溫均上升到42.0℃左右，且與運動前體溫相比均有顯著性差異，這與LAM（2013）及CHANG（2017）的熱射病大鼠模型相一致，說明這5組大鼠符合勞力性熱射病大鼠建模標準。與KING（2015）熱射病小鼠模型相類似，大鼠熱運動至力竭時出現(xiàn)了意識喪失，且意識喪失時所能達到的最高核心溫度為42.11～42.43℃，進一步證明本研究勞力性熱射病大鼠建模成功。

MCDERMOTT等[12]的研究認為快速降溫是熱射病救治的關鍵，在諸多降溫措施中，冷水浸泡的冷卻速率最快，其中2℃冷水浸泡的冷卻速率是0.35℃/min，8℃和20℃冷水浸泡的冷卻速率均為0.19℃/min；另外一些替代性冷卻策略，如冷卻水霧噴灑、靜脈冷卻注射、冰覆外周動脈、洗胃、降溫毯等由于冷卻速率過低而不建議用于熱射病快速冷卻的救治。低溫環(huán)境有助于冷卻病人。O'CONNOR[18]的研究發(fā)現(xiàn)-18℃和0℃的輻射冷卻速率分別為0.06℃/min和0.04℃/min，均優(yōu)于全身敷冰0.03℃/min的冷卻速率，提出輻射冷卻可以輔助其他冷卻方法，用于患者冷卻救治。WOHLFERT[19]的研究表明，在勞力性熱射病冷卻急救中，進行全身冷水浸泡（Cold water immersion，CWI）是降低患者核心溫度最有效的方法，可以使熱射病患者的存活率提升到接近100%。STEWART[13]等的研究認為：大部分勞力性熱射病患者具有41.0～43.5℃之間的核心體溫，而冷卻終止點時的核心體溫為38.9℃，針對每5 min降低1℃的冷卻速率，提出可以用冷水浸泡15 min，或者提供合理的冷卻終止點進行冷卻治療。GODEK等[20]的研究發(fā)現(xiàn)：10℃冷水浸泡時，越野賽運動員的冷卻速率為0.255℃/min，核心溫度從39.5℃降到37.5℃僅需要7.7 min。依據(jù)WOHLFERT的最新研究，本研究采用冷水浸泡作為勞力性熱射病大鼠的冷卻治療方法。本研究中，HEC1組大鼠19℃冷浸5 min后體溫降到低于運動前體溫，且顯著低于HER1組大鼠體溫；HEC2組大鼠19℃冷浸5 min體溫及休息60 min體溫均降到低于運動前體溫，且顯著低于HER2組大鼠休息5 min體溫及休息60 min體溫，說明19℃冷浸5 min可以有效降低勞力性熱射病大鼠體溫并能維持至少60 min時間。與MCDERMOTT，STEWART，GODEK等的研究有所不同，本研究中2組大鼠19℃冷水浸泡時冷卻速率分別為1.15和1.10℃/min，冷浸時間僅為5 min，比人體冷浸時降溫速率更快，冷浸時間更短，提示物種間的差異可能會產(chǎn)生不同的熱調(diào)節(jié)反應，來自動物冷卻實驗的數(shù)據(jù)，應用于馬拉松等耐力性運動項目勞力性熱射病發(fā)作后的冷卻急救時冷浸水溫及冷浸時間要作適當調(diào)整。在20℃環(huán)境中休息60 min期間，HER2組和HEC2組大鼠體溫均先下降再回升；且HEC2組大鼠體溫顯著低于HER2組大鼠同一時間點體溫，說明20℃環(huán)境休息不僅有助于降溫，也有助于維持冷卻治療效果，這與O'CONNOR低溫輻射冷卻可以輔助其它冷卻方法用于患者冷卻救治的研究類似，提示可以采用20℃環(huán)境休息輔助冷水浸泡的方法應用于馬拉松等耐力性運動項目中勞力性熱射病患者的冷卻救治。

3.2 運動及冷療對大鼠血液濃縮程度的影響

紅細胞壓積和血紅蛋白是血常規(guī)檢查中反映血液濃縮程度的重要指標。劇烈運動時大量出汗會使機體脫水，血液濃縮，紅細胞壓積和血紅蛋白會相對升高。測定紅細胞壓積及血紅蛋白有助于了解血液濃縮程度，因而可作為熱射病實驗室檢查指標。全軍重癥醫(yī)學專業(yè)委員會在熱射病規(guī)范化診斷與治療專家共識（草案）中，提出勞力性熱射病實驗室檢測指標應包括血常規(guī)檢測：熱射病發(fā)病早期因脫水致血液濃縮可出現(xiàn)血紅蛋白（Hb）升高、紅細胞壓積（Hct）增加、血小板（PLT）發(fā)病初期正常，繼而迅速下降等癥狀[21]。本研究中，HE組大鼠紅細胞壓積顯著高于NC組大鼠紅細胞壓積；證明大鼠進行高溫運動確實會因為脫水而引起機體血液濃縮，這與前人的研究結(jié)果相一致。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與NC組大鼠相比，HE組大鼠血紅蛋白濃度雖然升高，但并未引起顯著性差異，提示在反應血液濃縮程度方面，血紅蛋白不夠敏感。本研究中，HE組大鼠在高溫力竭運動誘導勞力性熱射病發(fā)作時出現(xiàn)紅細胞壓積顯著性升高，說明機體嚴重脫水，提示紅細胞壓積是高溫力竭運動中勞力性熱射病病理生理學改變的敏感指標，可作為馬拉松等耐力性運動項目勞力性熱射病研究的病理生理學指標。

RIANA[4]在海軍陸戰(zhàn)隊馬拉松運動中勞力性熱射病處理流程中提出：冷水浸泡是熱射病患者救治的首選方案；冷卻啟動后，應獲得患者的血液化學樣品，即時檢測鈉Na，葡萄糖Gluc，鉀K，肌酐Cr、血尿素氮BUN，氯Cl和紅細胞壓積Hct等；治療脫水、低血糖和低鈉血癥。關于冷卻對血液濃縮程度影響的研究鮮為報道。LIPINA[22]在研究大鼠血液粘度的溫度依賴性時，發(fā)現(xiàn)冷卻會使大鼠血液濃縮，紅細胞壓積升高。與LIPINA的研究不同，本研究中大鼠在冷浸后即刻及其后60 min時紅細胞壓積及血紅蛋白雖然有下降及恢復正常的趨勢，但并未出現(xiàn)顯著性變化，說明冷浸對高溫力竭運動造成的血液濃縮影響不明顯，提示冷浸并未明顯改善機體的脫水狀況。

3.3 勞力性熱射病大鼠冷卻治療中抗利尿激素調(diào)節(jié)機制探討

CASA等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，運動時水分丟失是引起體溫升高的重要因素?？估蚣に兀ㄒ喾Q精氨酸加壓素）是機體調(diào)節(jié)水平衡的重要激素，它是由下丘腦視上核和視旁核的神經(jīng)元細胞體合成并分泌的9肽激素，通過神經(jīng)垂體后葉釋放入血液，主要作用是調(diào)節(jié)腎臟對水的重吸收，引起尿液濃縮，起到抗利尿效果。除了通過抗利尿（抗脫水）途徑維護體溫調(diào)節(jié)的作用外，抗利尿激素還是重要的內(nèi)源性體溫調(diào)節(jié)因子，AVP及其V1a受體拮抗劑能夠分別誘導低體溫和高體溫。在研究大鼠視前-下丘腦對溫度敏感神經(jīng)元和對溫度不敏感神經(jīng)元對體溫調(diào)節(jié)的精確反應時，TANG等[24]通過監(jiān)測神經(jīng)元的放電活動和熱敏感性變化發(fā)現(xiàn)，AVP增加了65%溫敏神經(jīng)元的自發(fā)放電率，并幾乎降低了50%冷敏神經(jīng)元和對溫度不敏感神經(jīng)元的自發(fā)放電率，由于興奮溫敏神經(jīng)元或抑制冷敏和不敏感神經(jīng)元會促進熱量損失或抑制熱量生產(chǎn)和保存，因而提出AVP興奮溫敏神經(jīng)元以及抑制冷敏神經(jīng)元和不敏感神經(jīng)元是AVP誘導體溫過低的可能機制。

熱射病實驗室檢查中，有關抗利尿激素的研究并不常見。在利用肝移植治療勞力性熱射病后肝衰竭患者的研究中，SAISSY等[25]證明，勞力性熱射病會引起急性肝衰竭，這不僅與高熱會直接損傷肝實質(zhì)有關，也與抗利尿激素分泌過多使血液再分配引起的急性肝缺血病情加重有關。在研究倫敦馬拉松運動相關低鈉血癥的發(fā)生率時，KIPPS[26]證實，運動性低鈉血癥是耐力運動中一種潛在的致死原因，它與運動過程中抗利尿激素過度釋放有關。本研究中，相比于NC組大鼠，HE組大鼠在高溫力竭運動誘導勞力性熱射病發(fā)作時出現(xiàn)下丘腦抗利尿激素AVPmRNA表達、下丘腦抗利尿激素AVP蛋白表達、血液抗利尿激素均非常顯著性上調(diào)，提示勞力性熱射病與運動過程中抗利尿激素過度合成與釋放有關，這與SAISSY及KIPPS的抗利尿激素與疾病關系研究相類似，說明勞力性熱射病發(fā)作時機體出現(xiàn)過度抗利尿反應，以此對抗高溫力竭運動引起的高體溫及嚴重脫水情況。此結(jié)果進一步提示抗利尿激素、抗利尿激素AVPmRNA表達及抗利尿激素AVP蛋白表達是高溫力竭運動中勞力性熱射病病理生理學改變的敏感指標，可作為馬拉松等耐力性運動項目勞力性熱射病研究的病理生理學標志物。

JASNIC等[27]的研究表明，除了熱暴露，冷暴露也能誘導下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的激活和抗利尿激素（AVP）的釋放，二者均能引起下丘腦AVP蛋白表達的顯著性升高；且38℃熱應激引起的AVP升高比4℃冷應激引起的AVP升高更顯著。與JASNIC的研究不同，本研究中，在冷浸后即刻及其后60 min時，AVPmRNA表達均非常顯著性下調(diào)、AVP蛋白表達均顯著性下調(diào)；而血液AVP均未出現(xiàn)顯著性變化。這種現(xiàn)象說明冷浸對下丘腦AVPmRNA表達的影響最顯著，對下丘腦AVP蛋白表達的影響次之，而對血液AVP的影響甚微；進一步證明冷浸對抗利尿激素的影響符合從下丘腦AVPmRNA表達到下丘腦AVP蛋白表達，再到AVP釋放入血液的逐級滯后的合成與釋放順序。這種現(xiàn)象也說明冷浸后60 min的20℃環(huán)境休息延續(xù)了冷浸對AVP的影響，有助于維持冷卻治療效果。AVPmRNA表達及AVP蛋白表達反映的是AVP在下丘腦的合成情況。冷浸治療后，AVPmRNA表達非常顯著性下調(diào)、AVP蛋白表達顯著性下調(diào)，說明冷浸治療降低了抗利尿激素在下丘腦的合成，其機制可能是機體降溫后病情開始轉(zhuǎn)歸，依賴AVP抗脫水及誘導低體溫的作用減弱，機體試圖通過減少AVP的合成來減弱過度抗利尿反應重建自身體溫調(diào)節(jié)。血清AVP反映的是AVP合成后釋放入血的情況。冷浸后血清AVP雖然比熱射病發(fā)作時有所下降，但并沒有出現(xiàn)顯著性差異；在其后60 min的20℃環(huán)境休息中，AVP雖然有所上升，但也沒有出現(xiàn)顯著性差異，說明冷浸治療對抗利尿激素的釋放沒有明顯影響，冷浸不會引起尿量增多及加重脫水的情況，其機制與AVP釋放入血的過程滯后于下丘腦AVP的合成有關。研究結(jié)果提示，下丘腦AVPmRNA表達及AVP蛋白表達是勞力性熱射病冷卻急救中病情轉(zhuǎn)歸的敏感指標，可作為馬拉松等耐力性運動項目勞力性熱射病冷卻急救研究的病理生理學標志物；而血清AVP不是勞力性熱射病冷卻急救中病情轉(zhuǎn)歸的敏感指標。

4 結(jié) 論

冷浸可以快速降低熱射病大鼠機體核心溫度；使AVPm-RNA表達及AVP蛋白表達顯著性下調(diào)，改善抗利尿激素在下丘腦的合成；但是冷浸對血清AVP和Hct沒有顯著性影響，不能明顯改善抗利尿激素在下丘腦的釋放以及改善機體脫水狀況。