響應面法優(yōu)化太空茄子葉總黃酮的提取工藝

楊彬，金小青，李彩霞，焦揚

(1.河西學院農業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000；2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室，甘肅 張掖 734000)

茄子(SolanummelongenaL.)為茄科茄屬，別名落蘇、酪酥、昆侖瓜等，是為數(shù)不多的紫色蔬菜之一，也是一味中藥[1].茄子種植廣泛，價格低廉，取材容易，其花、果、莖、葉、根均可藥用，無毒、甘寒、具有活血散癖、消腫止痛、寬腸理氣之功效[2].太空茄子通過太空誘變及日光溫室加代選育后，再經(jīng)雜交選育，形成了具備高產、抗病性強、營養(yǎng)成分高等特點的新品種.而茄葉為茄子采收過程中下腳料之一，主要作為肥料或廢料處理，附加值較低.茄葉中富含多糖、龍葵堿、茄尼醇、咖啡酸、黃酮、揮發(fā)油、多酚等多種有效成分[3-7].黃酮作為茄葉中主要成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗凝血、抑菌、防止心血管疾病、調節(jié)激素、防護、抗氧化、抗衰老作用[8-12]，因而具有較高的藥理及保健開發(fā)價值，已成為醫(yī)藥、食品領域的研究熱點.

周寶利等[13]采用有機溶劑提取茄子中總黃酮，并對不同品種黃酮含量進行了測定；李睿等[14]采用微波輔助提取茄子根中總黃酮；王治業(yè)等[15]對茄子皮中總黃酮提取工藝進行了優(yōu)化；安紅鋼等[16]對茄蒂中黃酮含量進行測定并分析其對自由基的清除效果的影響；莫天錄等[17]對綠茄葉黃酮的純化工藝進行了研究.綜上所述，目前茄子的副產品研究主要局限于茄子不同部位的研究，而關于太空茄子葉總黃酮方面的研究尚未見報道，為提高太空茄子采摘后的茄葉的附加值，對其黃酮提取工藝進行分析，提高資源利用價值.本試驗以太空茄子葉為研究材料，采用單因素和響應面試驗優(yōu)化太空茄子葉中總黃酮的提取工藝條件，利用HPLC確定其總黃酮的單體組成，為試材的進一步研究和開發(fā)提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試材：太空茄子葉采摘于河西學院農業(yè)試驗園.

試劑：C2H5OH、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Na2CO3等藥品為國產分析純；C2H3N、CH3OH、H3PO4為國產色譜純.蘆丁標準品(批號：100080-201610)、阿魏酸標準品(批號：110773-201012)、槲皮素標準品(批號：100081-200907)均購自北京世紀奧科生物技術有限公司.

1.2 儀器與設備

河南省鞏義市英峪予華儀器廠生產的SHZ-2000型雙配套循環(huán)水式多用真空泵；上海棱光技術有限公司生產的Spectrμmlab24分光光度計；國華電器有限公司生產的HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋；AL204 Mettler Toledo公司生產的分析電子天平；美國PerkinElmer公司生產的2000Autosampler高效液相色譜儀.

1.3 試驗方法

1.3.1 太空茄子葉的處理 茄子葉片清洗，陰干粉碎(60目)后利用石油醚(料液比1∶5)回流2.5 h，除去茄葉中的色素等物質后，風干備用.

1.3.2 太空茄子葉黃酮的提取

1.3.2.1 總黃酮提取 稱取0.5 g處理后的太空茄子葉粉末置于100 mL蒸餾瓶，不同料液比環(huán)境中，加入不同體積分數(shù)的乙醇，設置不同的溫度、時間回流提取，冷卻后真空抽濾，取濾液置于50 mL容量瓶，并用對應體積分數(shù)的乙醇定容，根據(jù)標準曲線測定總黃酮含量.

1.3.2.2 單因素試驗 準確稱取樣品0.50 g，在提取溫度為80 ℃、料液比1∶40(g/mL)加入體積分數(shù)70%的乙醇溶液、提取1.5 h的條件下，固定其他條件不變，各因素的水平梯度設置分別為提取時間1、1.5、2、2.5 h；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)；提取溫度60、70、80、90 ℃；乙醇體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%；以總黃酮得率為指標，進行單因素試驗，每個試驗重復3次.

1.3.2.3 太空茄子葉黃酮提取條件試驗設計 在其他條件固定的試驗設置下，分別研究提取時間(X1)、料液比(X2)、乙醇體積分數(shù)(X3)對太空茄子葉黃酮提取效果的影響.單因素試驗，用Design Expert 8.0軟件設計Box-Behnken試驗，試驗設計見表1.

1.3.3 標曲繪制和黃酮得率計算

1.3.3.1 測定波長 將蘆丁標準液與稀釋30倍的回流提取液各0.5 mL、加0.3 mL 5%亞硝酸鈉混勻后反應6 min、繼續(xù)加0.3 mL 10%硝酸鋁反應6 min、再加入4.00 mL 4%氫氧化鈉顯色之后，用30%的乙醇定容至10 mL，在400～600 nm下得到黃酮的最大吸收波長.

表1 試驗因素與水平設計

1.3.3.2 蘆丁標準曲線的繪制 標準曲線的制作參照高海寧等[18]的方法.稱取蘆丁20.0 mg，用少量75%乙醇溶解后移至100 mL容量瓶并定容，得到質量濃度為0.2 mg/mL蘆丁標準品，冷藏備用.取蘆丁標準溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分別置于10 mL容量瓶，加0.3 mL 5%亞硝酸納溶液搖勻后靜置6 min，然后加0.3 mL 10%硝酸鋁溶液搖勻后靜置6 min，再加入4.00 mL 4%氫氧化鈉，用30%的乙醇定容至刻度搖勻后靜置15 min.以空白試劑為對照，508 nm波長處測定吸光度.以吸光度為縱坐標，蘆丁質量為橫坐標作標準曲線，得出回歸方程y=0.902 4x+0.005 4，R2=0.999 6.

1.3.3.3 太空茄子葉黃酮得率計算 按1.3.1.1方法提取太空茄子葉總黃酮，準確吸取一定體積的濾液，按繪制標準曲線的方法，測定吸光度，根據(jù)回歸方程，求總黃酮得率.

式中，50是定容后濾液體積(mL)；v為加入反應體系中的濾液體積(mL)；m為處理后稱取的茄葉粉末質量(mg).

1.4 提取液中黃酮的定性鑒定

1.4.1 顯色反應 取適量的樣品溶液，分別與氫氧化鈉溶液、硼酸溶液、三氯化鐵、乙酸鎂、鹽酸-鎂粉、三氯化鋁反應，觀察顏色變化，并紫外燈照射，觀察熒光反應.

1.4.2 液相色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm).流動相：A為乙腈溶液，B為0.1%的磷酸溶液，梯度洗脫程序為：0～10 min，10%的乙腈；10～30 min，10%～30%的乙腈；30～60 min，30%～40%的乙腈；60～90 min，40%～70%的乙腈；90～130 min，70%～90%的乙腈；進樣量為10 μL，檢測波長326 nm.以標準樣品保留時間和樣品比較，確定樣品中存在的黃酮類成分.

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003數(shù)據(jù)處理，Origin 7.5軟件進行作圖，圖中數(shù)據(jù)均為3次數(shù)據(jù)的平均值加標準誤差，采用Design Expert 8.0軟件(ANOVA)進行方差分析.

2 結果與分析

2.1 總黃酮的測定波長

蘆丁標準液與太空茄子葉提取液顯色后在400～600 nm可見光區(qū)域掃描.結果表明，標樣和樣液的最大吸收峰都在508 nm處，因此選擇508 nm作為太空茄子葉黃酮測定波長.

2.2 單因素試驗

2.2.1 提取時間對總黃酮得率的影響 提取時間對太空茄子葉總黃酮得率的影響如圖1所示.太空茄子葉總黃酮得率隨提取時間的延長呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，提取時間為1.5 h，總黃酮得率為最大值.由Fick擴散定律可知[19]，在一定時間內，總黃酮得率與提取時間呈正相關；當提取時間過長時，太空茄子葉中其他成分溶出量增多，導致總黃酮得率下降.因此，確定提取時間為1.5 h作為響應面試驗的中心點.

圖1 提取時間對總黃酮得率的影響Figure 1 Effects of time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 料液比對總黃酮得率的影響 液比對太空茄葉總黃酮得率的影響見圖2.在其他條件不變的前提下，隨料液比的增大，總黃酮得率相應升高，料液比為1∶40(g/mL)時，總黃酮得率最高；由于細胞內和提取溶劑之間濃度梯度增加，傳質效果增加[20]，得率不斷增加；當料液比超過1∶40(g/mL)時，總黃酮得率下降；可能是由于太空茄葉中其他雜質成分的溶解性增加，導致得率下降；因此，選擇料液比為1∶40(g/mL)為后續(xù)響應面試驗的中心點.

圖2 料液比對總黃酮得率的影響Figure 2 Effects of solid-to-liquid ratios on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 提取溫度對總黃酮得率的影響 由圖3可知，總黃酮得率隨溫度的升高而升高，當溫度高于80 ℃時，總黃酮得率上升趨勢比較緩慢，原因可能是溫度升高時，細胞間的碰撞加速使細胞破裂，總黃酮溶解速度加快；但總黃酮在較高溫度下，由于其穩(wěn)定性較差[21]，使其結構發(fā)生破壞，從而影響其得率；當提取溫度為80 ℃時，與提取溫度為90 ℃二者得率進行比較，二者差異不顯著(P<0.05)，從節(jié)約能耗角度考慮，選擇80 ℃為提取最佳溫度.

圖3 提取溫度對總黃酮得率的影響Figure 3 Effects of temperatures on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響 由圖4可知，隨乙醇體積分數(shù)增加，太空茄子葉總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，乙醇體積分數(shù)為80%時，太空茄子葉總黃酮得率最高.可能是隨乙醇溶液體積分數(shù)增加，總黃酮極性和一定體積分數(shù)的乙醇極性相似；乙醇體積分數(shù)過大時，茄子葉中醇溶性雜質大量溶出，影響總黃酮溶出效果，導致總黃酮類物質得率降低.因此，確定以80%體積分數(shù)的乙醇為后續(xù)響應面試驗的中心點.

圖4 乙醇體積分數(shù)對總黃酮得率的影響Figure 4 Effects of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 黃酮類化合物提取工藝回歸模型的建立及響應面分析

2.3.1 回歸方程的建立 單因素試驗，對影響太空茄子葉中總黃酮得率的主要因素提取時間、乙醇體積分數(shù)和料液比采用BB試驗設計，試驗結果見表2.

用Design Expert 8.0軟件對表2試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得到太空茄子葉中總黃酮類化合物的提取率(Y)與提取時間(A)、料液比(B)和乙醇體積分數(shù)(C)各因素變量之間的函數(shù)關系：

Y=9.56+0.30A+0.18X2-0.39C-0.075AB-0.039AC-0.055BC+0.18A2-0.59B2- 1.08C2

為說明回歸方程的有效性以及各因素對總黃酮得率的影響程度，對回歸方程進行方差分析，結果見表3.

從表3可以看出，模型P=0.002<0.01，說明此模型極顯著；失擬項P=0.111 6>0.05，不顯著，擬合程度較好.R2=0.936，說明93.6%可用此模型來解釋各因素與總黃酮得率之間的關系.C(乙醇體積分數(shù))、C2(乙醇體積分數(shù)二次項)、B2(料液比二次項)對太空茄子葉總黃酮得率達到極顯著水平；A(提取時間)對總黃酮類化合物提取率影響差異顯著(P<0.05)，其他項影響不顯著(P>0.05).

表2 響應面試驗設計及結果

表3 響應面方差分析二次模型方差分析表(部分平方和- Ⅲ型)

**差異極顯著P<0.01;*差異顯著P<0.05.

**P<0.01；*P<0.05.

由F值表明，各因素對太空茄子葉總黃酮得率的影響順序由大到小依次為：乙醇體積分數(shù)>提取時間>料液比.

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化 從圖5分析可以看出，各因素的效應值隨著自變量(試驗因素)的變化為：隨著提取時間的單獨延長，得率的變化趨勢是緩慢增加，其曲線較平緩，說明提取時間對響應值影響不顯著；隨著料液比的單獨增加，提取率變化趨勢是先增加后下降，其曲線傾斜度大，表明料液比對響應值影響顯著；隨著乙醇體積分數(shù)的增大，提取率的變化趨勢是先增加后迅速下降，其曲線傾斜度較大，說明乙醇體積分數(shù)對總黃酮的提取率影響較大，對響應值影響較大.

從圖6-A可以看出，固定乙醇體積分數(shù)，隨著提取時間的延長，總黃酮得率先急劇增大，其變化曲度較陡峭，說明該因素對總黃酮提取影響較大，從響應面和等高線可以看出，在提取時間為1.8 h時，料液比為1∶40時黃酮提取率最高.

圖5 單因素效應與總黃酮提取率的關系圖Figure 5 Relations between single factor effect and total flavonoids extraction yield

從圖6-B可以看出，當提取時間一定時，隨乙醇體積分數(shù)的增大，太空茄子葉中總黃酮得率先緩慢升高后迅速降低，其變化曲度較大；當乙醇體積分數(shù)一定時，隨提取時間延長，總黃酮的提取率逐漸升高.從響應面圖可知，提取時間為1.8 h時，乙醇體積分數(shù)80%時總黃酮提取率最高.

由圖6-C可知，隨料液比的升高，太空茄子葉中總黃酮得率先緩慢升高，后緩慢降低；相比而言，較乙醇體積分數(shù)的變化趨勢較大，說明對總黃酮得率的影響較大.從響應面和等高線可以看出，當料液比為1∶40時，乙醇體積分數(shù)80%總黃酮得率有最高響應值.

圖6 逐因素交互作用對總黃酮得率的影響Figure 6 Effects of each eactor interaction on extraction yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工藝條件的預測和檢驗 通過二次多項回歸的預測，得出太空茄子葉總黃酮提取的最佳條件為提取時間1.830 h、料液比1∶42.23(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)78%，此時的太空茄子葉總黃酮得率預測值為9.87%.結合現(xiàn)實的操作過程和便捷性，將其提取工藝參數(shù)修正為：提取時間1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)78%，、測定得到總黃酮得率為9.82%.說明建立的模型與實際情況基本吻合.

2.4 提取液中黃酮的定性鑒定

2.4.1 顏色反應 由表4可知，太空茄子葉黃酮提取液中確定含有黃酮類化合物，如黃酮醇，查爾酮異黃酮等.

表4 顏色反應試驗結果

2.4.2 液相色譜 由圖7可知，在10.19 min出峰的是蘆丁標準品；在11.27 min出峰的是阿魏酸標準品；在15.37 min出峰的是槲皮素標準品；在19.36 min出峰的是山奈酚標準品.由圖7與圖8對比可知，太空茄子葉黃酮中含有蘆丁、阿魏酸和槲皮素.此結論與羅慧玉等[22]采用HPLC確定杏花中阿魏酸、蘆丁和異槲皮苷方法一致.

圖7 黃酮標準品在326 nm 處的HPLC液相色譜圖Figure 7 HPLC chromatogram of favonoids standardd at 326 nm

圖8 太空茄葉總黃酮提取液在326 nm 處的HPLC 液相色譜圖Figure 8 HPLC chromatogram of favonoids extracts from space eggplant leaf at 326 nm

3 討論

植物活性物質的提取，其過程中目標產物的得率受料液比、材料粉碎度、浸提溫度和提取劑等多種因素的影響，在一定范圍內目標產物的得率隨著料液比的增加而增大，當達到一定程度后得率不再增加，這是由于在特定條件下一定比例的溶劑已基本將其提取完全[23-24].響應面優(yōu)化法通過對回歸方程的擬合度以及響應面工藝回歸模型的建立，可方便地求出相應于各因素水平的響應值.采用HPLC初步定性分析了太空茄子葉總黃酮的組分，未對單一組分得率為目標進行分析研究，在后續(xù)試驗中仍需進一步完善.通過優(yōu)化太空茄子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)，為后續(xù)總黃酮及其單體組分分離提供基礎數(shù)據(jù)，對擴大農作物資源、食品、生物工程以及化工領域的綜合利用范圍，提高其附加值，具有很好的社會效益和經(jīng)濟效益.

4 結論

用響應面法分析優(yōu)化太空茄子葉總黃酮的提取條件，經(jīng)優(yōu)化后的提取工藝可使太空茄子葉總黃酮提取率保持在9.82%以上的水平.通過單因素試驗和響應面分析、優(yōu)化提取太空茄子葉總黃酮的最佳工藝條件為：提取時間1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取溫度80 ℃、乙醇體積分數(shù)78%，最佳總黃酮得率可達9.82%.同時得到太空茄子葉總黃酮得率與各提取條件的二次多項式模型，該模型擬合度較好.通過定性試驗，其結果表明太空茄子葉黃酮提取物中含有多種黃酮類物質；由液相色譜結果可知其中含有蘆丁、槲皮素、阿魏酸.