基于16S rDNA高通量測(cè)序的玉米根際與非根際土壤細(xì)菌多樣性比較

徐麗霞，何永吉

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西太原030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，山西太原030031）

根系是植物和土壤之間物質(zhì)和能量的重要界面，也是土壤微生物活動(dòng)最活躍的部分[1-2]。植物根系特定分泌物和土壤養(yǎng)分相互作用形成了獨(dú)特的養(yǎng)分組成和微生物群落組成。有研究表明，玉米、大針茅和刺槐根際土壤中的有效氮（AN）、有效磷（AP）和有機(jī)碳（SOC）含量明顯高于非根際土壤[1-4]；在刺槐的研究中發(fā)現(xiàn)，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）的相對(duì)豐度在根際土壤中高于非根際土壤[4-5]。土壤細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，占土壤微生物總量的90%以上。植物根際土壤細(xì)菌參與了有機(jī)質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)化，N、P和K的循環(huán)以及植物激素和抗生素的分泌，為植物免受病原體侵害和植株健康生長(zhǎng)提供了保障[6]。

玉米（Zea maysL.）作為我國(guó)一種重要的糧食作物，廣泛種植于全國(guó)各地，產(chǎn)量居糧食作物第一[7-9]。近年來，玉米種植中化肥的施用不僅提高了土壤中N、P和K的含量，也改變了根際土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)；但關(guān)于玉米根際土壤養(yǎng)分與細(xì)菌多樣性的關(guān)系的研究甚少。

本試驗(yàn)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)玉米根際和非根際土壤細(xì)菌的16S rDNA的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行分析，研究N、P、K和有機(jī)肥配合施肥條件下，玉米根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性的差異，以探究玉米根際土壤養(yǎng)分與特定細(xì)菌類群的關(guān)系，為尋找玉米根際土壤中利于養(yǎng)分循環(huán)的細(xì)菌類群提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在山西省晉中市東陽鎮(zhèn)試驗(yàn)田進(jìn)行。該地區(qū)位于北緯 37°35′，東經(jīng) 112°51′；年平均氣溫為9.7℃，降水量為440.7 mm。試驗(yàn)進(jìn)行前，所有地塊均種植玉米。播種前施基肥：尿素141 kg/hm2、重過磷酸鈣141 kg/hm2、硫酸鉀145 kg/hm2和有機(jī)肥3 000 kg/hm2。其中，有機(jī)肥為豬糞，含水55%、總氮16.5 g/kg、P2O523.6 g/kg 和 K2O 15.8 g/kg；7 月底追施尿素100 kg/hm2。每個(gè)試驗(yàn)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)小區(qū)，每小區(qū)50 m2，行距和株距分別為70，25 cm。

1.2 土壤樣品的采集

2018年7月追肥前，分別在3個(gè)小區(qū)隨機(jī)采集玉米15株，先輕輕抖落根系外圍土壤作為非根際土壤（NRS）；再用毛刷輕輕刷下根表面土壤，均勻混合15株玉米根際的土壤視作根際土壤（RS）?；旌蠘悠贩謩e過0.5 mm篩，并分為2份，其中一份風(fēng)干用來測(cè)定土壤養(yǎng)分；另外一份保存于-80℃用于土壤細(xì)菌多樣性檢測(cè)。

1.3 土壤養(yǎng)分含量的測(cè)定

采用堿解擴(kuò)散法測(cè)定裂解氮（AN）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測(cè)定有效磷（AP）含量；采用乙酸銨浸提-原子吸收分光光度法測(cè)定有效鉀（AK）含量；采用凱氏定氮法測(cè)定全氮（TN）含量；采用堿熔-鉬銻抗分光光度法測(cè)定全磷（TP）含量；采用氫氧化鈉熔融-火焰原子吸收分光光度法測(cè)定全鉀（TK）含量；采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定有機(jī)碳（SOC）含量[10]；用SOC/TN表示土壤碳氮比（C/N）。

1.4 土壤DNA提取和細(xì)菌多樣性檢測(cè)

使用土壤DNA試劑盒（USAE.Z.N.A.R）從0.5 g土壤中提取DNA。采用細(xì)菌通用引物338F：5′-AC TCCTACGGGAGGCAGCA-3′和 806R：5′-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3′擴(kuò)增土壤樣品細(xì)菌16S rDNA的V3-V4可變區(qū)，并用Illumina技術(shù)進(jìn)行測(cè)序[11]。PCR 條件為 94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，71℃30 s，25個(gè)循環(huán)；71℃5 min。原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制過程中，丟棄模糊堿基和低質(zhì)量序列，最終序列長(zhǎng)不能低于150 bp。對(duì)過濾后的序列進(jìn)行連接，連接后的序列不低于10 bp，并去除嵌合體和錯(cuò)配堿基[12]。在序列相似度97%的情況下，將高質(zhì)量序列聚類為Operational Taxonomic Unit（OTU），用于種群分類。

1.5 數(shù)據(jù)分析

通過尋找最近祖先的方法，獲得每個(gè)樣品的OTU分類信息。使用Qime將修剪序列與Green Gene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以對(duì)每個(gè)分類群進(jìn)行豐度計(jì)算和分類，并進(jìn)行分類到屬級(jí)別的OTU豐度比較。樣本中的差異顯著性用SPSS軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)檢測(cè)。柱形圖采用Sigmaplot繪制，*表示顯著差異（P＜0.05）；冗余分析采用Canoco5.0軟件完成；采用R軟件進(jìn)行細(xì)菌群落非度量多維尺度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 施肥對(duì)玉米根際和非根際土壤養(yǎng)分含量的影響

N、P、K和C是植物生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)元素[13]，對(duì)玉米產(chǎn)量的形成有著重要的意義。從表1可以看出，AN、AP、SOC和C/N在根際土壤中較非根際土壤中顯著升高，分別升高26.61%，32.07%，73.32%和57.60%；而AK、TN、TP和TK在2種土壤中差異不大。

表1 不同樣品中養(yǎng)分含量的測(cè)定結(jié)果

2.2 施肥對(duì)玉米根際和非根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

從表2可以看出，6個(gè)土壤樣品的全部測(cè)序數(shù)據(jù)包含286 028條有效序列，其中，優(yōu)質(zhì)序列有230 636條，占總序列的80.63%。通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)，檢測(cè)到的有效序列主要分布在45個(gè)已知細(xì)菌門。根際土壤較非根際土壤能更確切地反映玉米根際土壤微生物的變化情況，施肥也是影響玉米根際土壤細(xì)菌群落變化的主要因素。結(jié)果表明，與非根際土壤相比，Chao和Shannon指數(shù)在玉米根際土壤中顯著升高，而Simpson指數(shù)的變化則在玉米根際土壤中顯著降低。

表2 不同樣品中土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和測(cè)序序列

2.2.1 施肥對(duì)玉米根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性在門水平上的影響 在門的分類水平上，有10個(gè)細(xì)菌門，在玉米根際和非根際土壤樣品中占細(xì)菌總數(shù)的96%～97%。結(jié)果表明，與非根際土壤相比，根際土壤中Proteobacteria、Actinobacteria和擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度均增加，分別增加了9.82%，5.00%和3.42%；Acidobacteria、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）和浮游菌門（Planctomycetes）的相對(duì)豐度均降低，分別降低了11.73%，1.36%，2.09%和7.11%；疣微菌門（Verrucomicrobia）、綠屈撓菌門（Chlor of lexi）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對(duì)豐度在根際和非根際土壤樣品中差異不大（圖1）。

2.2.2 施肥對(duì)玉米根際和非根際土壤細(xì)菌多樣性在屬水平上的影響 從圖2可以看出，有44個(gè)屬在至少一個(gè)樣品中的相對(duì)豐度大于0.1%，且Lysobacter、Pseudomonas、Nocardioides、Bacillus、Balneimonas、Chitinophaga、Saccharothrix和Streptomyces等 37個(gè)屬的相對(duì)豐度在根際土壤中顯著高于非根際土壤，且Kribbella的豐度最大，為1.73%；Bradyrhizobium、Gemmata和Planctomyces等7個(gè)屬的相對(duì)豐度在非根際土壤中顯著高于根際土壤，其中，Planctomyces的豐度最大，為2.89%。對(duì)44個(gè)屬在2個(gè)土壤樣品中的相對(duì)豐度進(jìn)行非度量多維尺度分析，結(jié)果顯示（圖3），不同的土壤樣品分別聚在一起，彼此分離，但根際與非根際土壤細(xì)菌類群間差異不顯著（F＝546.33，P＝0.1）。

2.2.3 土壤養(yǎng)分和細(xì)菌群落的關(guān)系 冗余分析結(jié)果顯示，土壤養(yǎng)分與細(xì)菌在門和屬水平上相對(duì)豐度的關(guān)系如圖4所示。由圖4-a可知，在門的水平上，第1軸和第2軸分別解釋了變量的92.58%和3.46%；Proteobacteria、Actinobacteria、Verrucomicrobia和Bacteroidetes的相對(duì)豐度與AN和SOC含量及C/N呈正相關(guān)，Acidobacteria和Gemmatimonadetes的相對(duì)豐度與AP含量呈正相關(guān)。圖4-b結(jié)果顯示，在屬的水平上，第1軸和第2軸分別解釋了變量的99.32%和 0.05%；Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的豐度與AN和SOC含量及C/N呈正相關(guān)；Bradyrhizobium的豐度與AK的含量呈正相關(guān)，與AN和SOC的含量及C/N呈負(fù)相關(guān)；Gemmata和Planctomyces的相對(duì)豐度與AK呈負(fù)相關(guān)，與AP呈正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

植物根系產(chǎn)生的分泌物能形成特定的根周環(huán)境及根際土壤獨(dú)特的理化性質(zhì)和微生物群落分布。前人研究表明，根際土壤中AN、AP和SOC的含量提高，更有利于作物根系的吸收，并通過植物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)保障作物產(chǎn)量穩(wěn)定[1-4]，這與本試驗(yàn)的部分研究結(jié)果一致。C/N＝25是土壤微生物分解有機(jī)質(zhì)的最適值；C/N＞25時(shí)表明氮素缺乏；C/N＜25時(shí)可促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)并釋放多余的氮，利于植物生長(zhǎng)[14]本研究中，根際土壤中AN，AP和SOC含量較高時(shí)，C/N為10.85，為微生物的繁殖提供了有利的環(huán)境。

Chao和ACE指數(shù)越大說明土壤樣品中微生物物種的豐富度越高[12]；Simpson指數(shù)越大說明樣品中優(yōu)勢(shì)種越多，其他非優(yōu)勢(shì)物種所占的比例則會(huì)減少，群落多樣性就越低[15]。玉米根際土壤中，Chao和ACE指數(shù)在根際土壤中高于非根際土壤，Simpson指數(shù)則反之。說明根際土壤中有較高的微生物多樣性，并有一些特定的優(yōu)勢(shì)菌群。

本研究表明，在門的水平，Proteobacteria和Actinobacteria的相對(duì)豐度在根際土壤中顯著高于非根際土壤。有研究表明，Proteobacteria和Actinobacteria是富營(yíng)養(yǎng)菌，適宜生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)豐富的土壤中，這與根際土壤中有較高的AN、AP和SOC密切相關(guān)[16]。在屬的水平，根際土壤中Bacillus、Chitinophaga、Pseudomonas、Lysobacter、Nocardioides、Balneimonas、Saccharothrix和Streptomyces的相對(duì)豐度高于非根際土壤。前人研究發(fā)現(xiàn)，Bacillus具有溶解磷、固氮、降解蛋白質(zhì)等生物聚合物和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能[17-18]；Streptomyces能夠分泌固氮酶、植物激素IAA、多胺和抗生素[19-20]；Balneimonas被重新分類為Microvirga，而Microvirga的一些物種有固氮功能；Pseudomonas可以降解土壤中的醇、醚和農(nóng)藥甲拌磷，并有助于腐殖質(zhì)的形成[21-23]；Flavobacterium能分泌多種酶來降解各種碳源，形成良好的土壤環(huán)境[24]；Chitinophaga降解多糖和蛋白質(zhì)分泌物[25]；Nocardioides降解多菌靈等含有苯環(huán)的有機(jī)物[26]；Lysobacter和Saccharothrix能夠分泌抗生素作為生物抑菌劑[27-28]。Bradyrhizobium和Gemmate在非根際土壤中顯著高于根際土壤，研究表明：Bradyrhizobium與豆科植物共生固氮，并能溶解磷酸鹽，產(chǎn)生鐵載體，抑制一些病原體，如鐮刀菌、絲核菌和殼球孢菌[29-30]；Gemmate可促進(jìn)脲酶的分泌，脲酶可促進(jìn)酰胺類物質(zhì)分解，進(jìn)而提高有機(jī)質(zhì)的利用率[29]。結(jié)合以上研究結(jié)果推斷，玉米根際和非根際土壤中的Bacillus和Bradyr-hizobium可能參與溶磷和固氮；Streptomyces和Balneimonas可能參與固氮；Pseudomonas、Gemmate和Flavobacterium可能參與有機(jī)質(zhì)的分解和循環(huán)。

玉米根際土壤較非根際土壤有較高豐度的可利用養(yǎng)分和細(xì)菌多樣性。根際土壤中較高豐度的功能菌屬如Bacillus、Balneimonas、Pseudomonas、Flavobacterium和Streptomyces屬，可能參與土壤中有機(jī)質(zhì)、N和P的循環(huán)和利用。玉米根際為功能細(xì)菌的生存提供了特定的土壤微生態(tài)環(huán)境，功能細(xì)菌增強(qiáng)了根際土壤養(yǎng)分的循環(huán)和玉米的吸收，保障了玉米產(chǎn)量的穩(wěn)定。