熱激對大花蕙蘭褐變總酚及相關(guān)酶活性的影響

葛 坤，方 巖，王智慧，楊 旭，薛 斌

（太原學院園林科研所，山西太原030024）

大花蕙蘭因植株挺拔，花姿秀美，花色艷麗而備受人們喜愛。植物組培技術(shù)作為大花蕙蘭一種主要的繁殖方式，已日漸成熟，但褐變問題在大花蕙蘭組培過程中普遍存在，這不僅制約了原球莖誘導愈傷組織分化，嚴重時會導致外植體死亡，大大降低了大花蕙蘭組培的增殖率[1]。鄭迎冬等[2]以大花蕙蘭幼嫩莖段為外植體，原球莖的誘導率很低，僅為30%。陳建科等[3]用幼嫩葉片作為組培外植體，并在培養(yǎng)基中增加了無機鹽濃度來抑制褐變。

最新研究表明，對葉片外植體進行熱激處理、水楊酸處理等可降低褐變程度[4]。大多數(shù)研究人員將熱激處理可降低組培褐變歸因于熱激處理抑制了PAL活性，PAL是酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，故熱激處理使得酚類物質(zhì)大大減少[5]。楊谷良等[6]通過對寶華甜柿葉片外植體進行熱激處理，降低了褐變率。楊玲等[7]分析了熱激處理對蝴蝶蘭組培褐變的影響，并通過正交試驗篩選了適宜的熱激處理條件。

本研究以大花蕙蘭組培瓶苗為試材，比較熱激處理與未熱激處理的葉片外植體褐變程度，通過分析熱激處理對總酚合成及PAL、PPO、POD活性的影響，以揭示熱激處理對大花蕙蘭組培褐變有效抑制的生理機制，為大花蕙蘭組培繁殖的生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為北京園林科研所培養(yǎng)的大花蕙蘭瓶苗，該瓶苗已進行生根培養(yǎng)6個月，培養(yǎng)基為1/2 MS＋IBA0.5 mg/L＋活性炭1.0 g/L，pH值為5.7。

1.2 試驗方法

將部分已生根未褐變的瓶苗進行45℃熱激處理，即在電熱恒溫鼓風干燥箱中加熱至瓶內(nèi)溫度達到45℃時停止，處理時間因各實驗室溫度不同而有差異。選擇已熱激處理及未經(jīng)處理（CK）的瓶苗各100瓶，葉片切割為0.8 cm×0.8 cm，接種于MS＋6-BA 5.0 mg/L（pH值5.6～5.8）培養(yǎng)基上進行增殖繼代培養(yǎng)，接種前經(jīng)熱激處理的瓶苗于自然光照培養(yǎng)架上恢復5～6 h。每瓶接種3個外植體，溫度25℃，光照2 000～3 000 lx，光照時間12 h/d。接種后第0，3，6，9天進行取樣，用蒸餾水將樣品培養(yǎng)基沖洗干凈后用濾紙擦干，放入干燥預冷研缽中，并迅速倒入液氮冷凍，研磨成粉末封袋，保存于-80℃低溫冰箱內(nèi)，待測生理指標，取樣需重復3次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu法，參考文獻[8]的測試法。稱取樣品2.0 g，置于圓底燒瓶，用甲醇定容至50mL。超聲振蕩30min后靜置24h。用50 mL 50%甲醇加熱回流1 h，抽濾，將濾渣加入50 mL 50%甲醇再次回流1 h，抽濾，將2次濾液合并定容至50 mL。移液管吸取沒食子酸0.2 mL，加入1.0 mL磷鉬酸試劑，后加入15 mL5%碳酸鈉溶液，攪拌30 min后，在波長765 nm處比色測定OD值。以沒食子酸濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標，建立標準曲線。將樣品替代沒食子酸，按以上步驟測定OD值，平行3次，將平均值代入線性回歸方程，計算樣品中總酚含量（mg/g）。

1.3.2 PAL活性測定 參照SOLECKA等[9]的方法。底物酚類物質(zhì)合成時，經(jīng)歷苯丙烷代謝途徑，催化L-苯丙氨酸發(fā)生脫氨反應形成反式肉桂酸，同時釋放NH3。稱取樣品0.1g，加入0.01gPVP，0.1 mol/L硼酸緩沖液1 mL（pH值8.8），5 mol/L疏基乙醇，于預先干燥的研缽中研磨成勻漿，離心15 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，取上清液作為酶提取液。反應液總體積4 mL，吸取0.2 mL酶液（另0.2 mL緩沖液作為對照），加入0.02 mol/L苯丙氨酸1 mL，蒸餾水2.8 mL，恒溫30℃，水浴攪拌30 min。采用紫外可見分光光度計測吸光度，波長為290 nm，吸光度值每變化0.01，表示生成1 μg反式肉桂酸，即為一個酶活性單位，用U/g來表示。

1.3.3 PPO活性測定 PPO是一種含有銅離子的氧化還原酶，催化酚類物質(zhì)生成褐色醌類物質(zhì)，故此種酶是引起植物褐變的關(guān)鍵酶。當植物受到機械損傷時，它存在于植物線粒體、葉綠體等細胞器、細胞壁和細胞膜上[10]。稱取2.0 g樣品，加入10 mL 0.1 mol/L的 PPS緩沖液（pH 值 6.0），0.5 g PVPP，于干燥研缽中研磨成勻漿，低溫下離心15 min，轉(zhuǎn)速為1 100 r/min，制得酶提取液。吸取3 mL0.05 mol/L PPS緩沖液（pH值6.0），加入1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，后再加入0.1 mL酶提取液，于525 nm處比色測定OD值，以蒸餾水作參比對照。OD值每分鐘變化0.01為一個PPO酶活單位（μmol/（mg·min））。

式中，ΔA為吸光值在反應時間內(nèi)的變化，W為樣品質(zhì)量，t為反應時間，D為稀釋倍數(shù)。

1.3.4 POD活性測定 參考王學魁等[11]的愈創(chuàng)木酚法。取50mL100mmol/L的磷酸二氫鈉（NaH2PO4）和磷酸氫二鈉（Na2HPO4）緩沖液，加入 28 μL愈創(chuàng)木酚溶液，振蕩使其混合均勻，加入30%的H2O2溶液作為反應混合液。稱取樣品1.0 g至干燥研缽中，分別加入1 mL NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液研磨。將研磨后的勻漿于4 000 r/min離心15 min，取上清液加入NaH2PO4和Na2HPO4緩沖液定容至100 mL。分別取1mL上述溶液，即1 mLNaH2PO4和Na2HPO4緩沖液，并分別加入3 mL預先配制好的反應混合液，紫外分光光度計中比色，波長為470nm。每1min讀數(shù)一次，共讀數(shù)5次，以每分鐘ΔA470變化0.01作為一個酶活性單位（nmol/（mg·min））。

式中，ΔA470為波長在470 nm下，每1 min所讀取的OD值；VT為酶液總體積；W為樣品質(zhì)量；VS為比色時吸取酶液體積；t為反應時間。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用SAS8.0軟件，圖中標準誤來自樣本的3個重復。用Word process system of fice軟件進行誤差分析，作圖采用Orihin 8.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱激處理對大花蕙蘭組培褐變的影響

從圖1可以看出，大花蕙蘭外植體增殖繼代培養(yǎng)期間，未經(jīng)熱激對照處理的外植體全部變成深褐色，且面積很大，經(jīng)過熱激處理的外植體略微變色，即未經(jīng)熱激對照處理的外植體褐變程度遠高于熱激處理的外植體，由此判斷，熱激處理對大花蕙蘭組培褐變有抑制作用。

2.2 熱激處理對大花蕙蘭組培褐變過程中總酚含量及酶活性的影響

2.2.1 總酚含量 酶、底物、氧是導致外植體褐變的主要因素，酚類物質(zhì)即是引起褐變的酶促底物。由圖2可知，未經(jīng)熱激對照處理組總酚含量變化相對平緩，熱激處理后使大花蕙蘭外植體的總酚含量逐漸降低。在第3，6，9天的外植體總酚含量比未經(jīng)熱激對照處理分別降低58.42%，67.21%，70.16%。

2.2.2 PAL活性 PAL活性變化情況如圖3所示。

從圖3可以看出，第3，6，9天抽取的樣品經(jīng)熱激處理的外植體PAL活性比未經(jīng)熱激對照處理低，其中，第3天抽取的降低了18.58%，降低幅度最大，第6，9天經(jīng)熱激處理的PAL活性比未經(jīng)熱激對照處理分別降低13.3%，10.47%。

2.2.3 PPO活性 由圖4可知，經(jīng)熱激處理的外植體PPO活性始終低于未經(jīng)熱激對照處理，由此得出，熱激處理對外植體PPO的活性有顯著抑制作用，第6天抽取的樣品中經(jīng)熱激處理的外植體PPO活性比未經(jīng)熱激對照處理低64.47%，第0，3，9天分別降低了36.94%，14.85%，29.38%。

2.2.4 POD活性 從圖5可以看出，熱激處理對外植體POD活性雖然有一定的抑制作用，但是不顯著。前3 d抽取的樣品經(jīng)熱激處理的外植體POD活性比未經(jīng)熱激對照處理略有下降，第6，9天抽取的樣品經(jīng)熱激處理的外植體POD活性比未經(jīng)熱激對照處理顯著升高。第0，3天抽取的樣品經(jīng)熱激處理的外植體POD活性比未經(jīng)熱激對照處理分別降低22.85%，21.14%，第6，9天POD活性分別升高51.85%，38.7%。

2.2.5 總酚含量與PAL、PPO和POD活性的相關(guān)性分析 大花蕙蘭葉片外植體總酚含量與3種酶活性相關(guān)性如表1所示，與PAL的相關(guān)系數(shù)為0.529 37，與PPO的相關(guān)系數(shù)為0.622 94，與POD的相關(guān)系數(shù)為-0.530 01。即PAL活性與總酚含量呈正相關(guān)，PPO活性與總酚含量也呈正相關(guān)，且相關(guān)性最大，POD活性與總酚含量呈負相關(guān)。

表1 總酚含量與PAL、PPO和POD活性的相關(guān)性分析

3 討論

蘭科植物組培過程中，外植體從原球莖誘導到繼代增殖，極易發(fā)生褐變[12]。褐變是植物細胞液泡內(nèi)的酚類物質(zhì)與細胞質(zhì)內(nèi)的酚氧化酶在外植體受到機械損傷，而使二者經(jīng)氧催化發(fā)生酶促氧化反應，形成褐色的醌類物質(zhì)和水，而醌類物質(zhì)經(jīng)酪氨酸酶催化，導致外植體蛋白質(zhì)發(fā)生聚合反應，最終使培養(yǎng)基變成褐色，外植體組織死亡[13]。在控制植物組培褐變的多種途徑中，熱激處理因安全、簡便已被多數(shù)研究中心應用。熱激處理是將植物外植體在超過其正常生長溫度范圍內(nèi)，處理一段時間后，誘導產(chǎn)生熱激蛋白（Heat shot protein，HSP），此蛋白可以保護植物體免受傷害[14]。KANABUS等[15]將馬鈴薯細胞經(jīng)過熱激處理（42℃）后，大量HSP合成，而使細胞內(nèi)其他蛋白的合成受到抑制。總酚含量及PAL、PPO、POD活性是確定褐變程度的重要指標[16]。PAL是酚類物質(zhì)合成的關(guān)鍵酶，植物細胞中，葡萄糖經(jīng)莽草酸途徑生成L-苯丙氨酸，后經(jīng)過苯丙烷代謝途徑生成酚類物質(zhì)。故PAL活性與酚類物質(zhì)的合成有著密切的聯(lián)系[17]。本研究顯示，熱激處理明顯減輕了大花蕙蘭葉片外植體的褐變程度。培養(yǎng)初期0～6 d，經(jīng)過熱激處理的外植體PAL活性及總酚含量低于未經(jīng)熱激對照處理。由此表明，熱激處理可抑制由機械損傷引起的大花蕙蘭葉片外植體的PAL活性。因熱激處理誘導產(chǎn)生熱激蛋白在細胞總蛋白合成一定的情況下，降低了PAL合成的誘導蛋白，PAL的代謝速率加快，PAL活性受到抑制，進而降低了總酚的合成，減少醌類物質(zhì)產(chǎn)生，減輕了褐變。

酚類物質(zhì)由PAL合成后經(jīng)PPO催化降解引起褐變[18]。FUKUMOTO等[19]將鮮萵苣經(jīng)熱激處理（50℃）后，測得PPO和POD合成受到抑制，降低了其活性。PPO屬于末端氧化酶，在植物中廣泛存在[20]。POD屬于氧化還原酶，在外植體褐變過程中，POD還原H2O2，為PPO降解酚類物質(zhì)提供了所需氧氣[21]。本試驗中，經(jīng)熱激處理的大花蕙蘭葉片外植體PPO活性低于未經(jīng)處理的，而POD活性未得到持久抑制。這表明，在大花蕙蘭組培中，PPO是催化酚類物質(zhì)形成醌類物質(zhì)的主要酶。

綜上所述，熱激處理可抑制組培期間葉片外植體PPO與PAL的活性，抑制了酚類物質(zhì)的氧化合成，進而減少了褐化物醌類物質(zhì)的產(chǎn)生，從而降低了大花蕙蘭葉片外植體褐變的發(fā)生。在總酚合成與3種酶相關(guān)性分析中可看出，總酚含量與PPO活性呈顯著正相關(guān)，與POD活性呈負相關(guān)。