丹參組織培養(yǎng)及快速繁殖

董靜靜，白鳳麟，劉瑞祥，雷海英，竇彩霞

（長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西長治046011）

丹參（Salvia miltiorrhizaBge.），又名紫丹參、血參、大紅袍等,為雙子葉唇形科（Labiatae）鼠尾草屬多年生草本植物[1]，主要以干燥根及根莖入藥[2]。目前，從丹參中分離到的化學(xué)成分有100多種，分為水溶性和脂溶性2類。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮丹參藥理藥效的主要成分是水溶性的酚酸類和脂溶性的丹參酮類[3-5]。丹參酮類是一類松香烷型二萜醌類化合物，主要包括丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、異丹參酮I、異隱丹參酮[6-8]；丹參酮類物質(zhì)大多從丹參根莖中提取得到[9]。此外，丹參還含有黃酮類、三萜類等成分，具有改善循環(huán)、抑制血小板凝聚、減少心肌損傷和抗氧化的作用[10-14]，常配伍用于治療心腦血管疾病炎癥、肝硬化等[15-17]。近幾年，隨著我國心腦血管類疾病發(fā)病率的上升，丹參的需求量逐年增加[18-19]。

本研究以丹參葉片為外植體，通過設(shè)置培養(yǎng)基的激素種類和濃度梯度，探索有效獲得丹參葉片愈傷組織高誘導(dǎo)率、較佳生長速度的激素配比，從而得到一套實用的丹參快速繁殖技術(shù)，旨在為改良丹參質(zhì)量、提高丹參產(chǎn)量和有效成分以及為丹參種植提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與主要試劑

供試丹參葉片來源于山西振東道地藥材開發(fā)有限公司。主要試劑有氯化汞，無水乙醇，95%乙醇，2，4- 二氯苯氧乙酸（2，4-D），6- 芐氨基腺嘌呤（6-BA），MS培養(yǎng)基所需藥品，蔗糖，氯化鈉，瓊脂粉，氫氧化鈉，萘乙酸（NAA），吲哚丁酸（IBA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丹參葉片消毒 采集大田生長的丹參葉片，用自來水沖洗掉表面的泥沙，放在超凈工作臺進行進一步消毒。將外植體放在無菌的培養(yǎng)皿中，用75%的酒精浸泡10 s左右，用無菌水漂洗3～4次，每次1～2 min；向培養(yǎng)皿中加入0.1%的氯化汞溶液，振蕩浸泡10 min，倒去浸泡過材料的氯化汞，用無菌水漂洗3～4次，每次1～2 min，并用無菌鑷子不停攪拌。

1.2.2 丹參葉片愈傷組織的誘導(dǎo) 將丹參葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，用無菌濾紙吸掉葉片表面水分并放入無菌培養(yǎng)皿中，使用無菌鑷子接種于附加不同濃度6-BA和2，4-D的MS固體培養(yǎng)基上（表1），記錄愈傷的增殖效應(yīng)以及后期的長勢情況。在黑暗條件下誘導(dǎo)形成愈傷組織，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每隔5 d觀察一次外植體的生長狀況，統(tǒng)計初始愈傷時間、染菌個數(shù)，計算愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 不同濃度激素配比的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基

1.2.3 不同激素配比對誘導(dǎo)芽的影響 將愈傷組織繼代培養(yǎng)后，挑選長勢良好的愈傷組織，接種于附加不同激素濃度的MS固體培養(yǎng)基[20]（表2），記錄愈傷的增殖效應(yīng)以及后期的長勢情況。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照培養(yǎng)，記錄不同濃度梯度培養(yǎng)基上最早的出芽點時間以及后期芽的長勢情況。30 d后，計算愈傷組織的萌芽數(shù)和萌芽率。

表2 不同濃度激素配比的愈傷組織芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對丹參葉片愈傷組織的影響

把葉片接種在2，4-D質(zhì)量濃度為0.5 mg/L、6-BA質(zhì)量濃度分別 0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L的 MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)，結(jié)果表明，當6-BA質(zhì)量濃度為0.5，1.0 mg/L時，丹參葉片長出愈傷組織時間最長，需要20 d左右，但其愈傷質(zhì)量不佳；6-BA質(zhì)量濃度為1.5，2.0 mg/L時，出愈時間約14 d，愈傷組織呈淡黃色且較大，無褐化現(xiàn)象（表3）。

表3 不同濃度激素配比對丹參葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

把葉片接種在6-BA質(zhì)量濃度為1.0 mg/L、2，4-D質(zhì)量濃度分別為 1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L的 MS的培養(yǎng)基上，結(jié)果表明，當2，4-D質(zhì)量濃度為1.0mg/L時，愈傷組織長勢良好，呈淡黃色；當2，4-D質(zhì)量濃度為1.5 mg/L時，愈傷組織較大，呈淡黃色，致密，無褐化，愈傷增殖快；當2，4-D質(zhì)量濃度為2.0 mg/L時，葉片長出愈傷時間最短，大約7 d，葉片切口皺縮、變厚，開始從葉片切口長出愈傷組織，且愈傷呈現(xiàn)淡黃色，生長后期愈傷組織不僅增殖快，而且沒有分化出芽，不褐化；當2，4-D質(zhì)量濃度為2.5 mg/L時，愈傷組織雖然長勢快，但是褐化比較嚴重?？赡苁怯捎?，4-D質(zhì)量濃度過高，導(dǎo)致愈傷組織內(nèi)多酚氧化酶活性升高，而使愈傷組織褐化[21]?？梢姡?，4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)影響較大，最適質(zhì)量濃度范圍是1.0～2.0 mg/L，濃度太低不利于誘導(dǎo)愈傷，濃度太高會影響愈傷質(zhì)量；增加6-BA濃度可以增加出愈率，但后期愈傷長勢不佳。綜合考慮，MS＋1.0 mg/L6-BA＋2.0 mg/L2，4-D可作為誘導(dǎo)丹參葉片愈傷組織的最佳培養(yǎng)基（表3）。

2.2 不同激素配比對丹參愈傷組織誘導(dǎo)芽的影響

選取在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長勢最好的愈傷組織誘導(dǎo)芽，進而探索不同激素濃度梯度對誘導(dǎo)芽的影響。由表4可知，在單獨使用6-BA誘導(dǎo)芽時，愈傷組織增殖速度快，6 d左右愈傷組織明顯長大，但是褐化現(xiàn)象嚴重，并且有大部分愈傷分化出根。說明6-BA單獨使用不利于誘導(dǎo)芽。在添加6-BA的基礎(chǔ)上再添加NAA，觀察6-BA和NAA這2種激素配比對誘導(dǎo)芽的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沒有長根現(xiàn)象發(fā)生，約4 d后在2.0 mg/L6-BA＋0.25 mg/LNAA的培養(yǎng)基上最先出現(xiàn)芽點，10 d后愈傷組織全部呈現(xiàn)淡綠色；7 d后，在1.5 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA培養(yǎng)基上出現(xiàn)芽點；而0.5mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA和1.0mg/L6-BA＋0.25mg/LNAA的培養(yǎng)基上約15d才出現(xiàn)芽點。說明2.0 mg/L的6-BA與一定濃度的NAA配比使用能較高效率地誘導(dǎo)芽。

表4 不同濃度激素配比對丹參愈傷組織誘導(dǎo)芽的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，丹參愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為 MS＋1.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L 2，4-D，其中，2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，濃度太低不利于誘導(dǎo)愈傷，濃度太高會影響后期愈傷質(zhì)量，導(dǎo)致愈傷褐化；增加6-BA濃度可以提高出愈率，但愈傷質(zhì)量較低。

試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)愈傷分化芽的最適培養(yǎng)基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L NAA，試驗中發(fā)現(xiàn)，單獨使用6-BA不利于誘導(dǎo)芽，與一定濃度的NAA配比使用能較高效率地誘導(dǎo)芽。

本研究探索了不同激素種類和濃度配比對丹參愈傷組織誘導(dǎo)芽的影響，為丹參提供了一套高效、快速、穩(wěn)定的繁殖方法，進而為丹參的快速繁殖提供了技術(shù)支持。