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    蓮草直胸跳甲OBP51的克隆及表達(dá)分析

    2019-07-23 07:42:38王亞茹劉艷紅馬瑞燕
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年7期
    關(guān)鍵詞:分析

    胡 軍 ,付 麗 ,王亞茹 ,張 彬 ,劉艷紅 ,賈 棟 ,馬瑞燕

    (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西太谷030801;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,山西太谷030801)

    蓮草直胸跳甲(Agasicles hygrophila)是全球入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵,其已在世界范圍內(nèi)用于防治該惡性雜草[1-2]。目前,生物防治是最有效的防治手段[3]。昆蟲(chóng)通過(guò)觸角辨別不同的氣味實(shí)現(xiàn)定位寄主植物[4],氣味分子通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入昆蟲(chóng)觸角淋巴液后,首先由氣味結(jié)合蛋白(OBP)將其運(yùn)輸并穿過(guò)淋巴液,送達(dá)神經(jīng)突觸上的氣味受體(OR),OR在收到氣味分子后,產(chǎn)生神經(jīng)沖動(dòng),實(shí)現(xiàn)化學(xué)信號(hào)與電信號(hào)的轉(zhuǎn)換,并最終引起昆蟲(chóng)吸引、取食、逃避等行為反應(yīng)[5-6]。因此,OBP能否攜帶特定的氣味物質(zhì)到達(dá)OR是昆蟲(chóng)能否識(shí)別氣味分子的關(guān)鍵。

    目前,已有多種昆蟲(chóng)OBP參與識(shí)別植物揮發(fā)物被報(bào)道。其中,草地螟(Loxostege sticticalis)OBP2對(duì)植物揮發(fā)性物質(zhì)中含量最高的反式-2-依維派鈉、順式-3-己烯基乙酸鹽有高的親和力和強(qiáng)的電生理反應(yīng)[7];白背稻虱(Sogatella furcifera)OBP2、OBP11對(duì)水稻揮發(fā)物2-十三烷酮、β-紫羅蘭酮有高親和力[8];苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)OBP10 對(duì)6種植物宿主揮發(fā)物月桂烯、β-蒎烯、β-紫羅蘭酮、3- 己酮、(E)-2- 己烯醛、1- 己醇有高的親和力[9];中華蜜蜂(Apis cerana)OBP2、CSP3對(duì)花揮發(fā)物 β-紫羅蘭酮均有高親和力[10];棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpa armigera)OBP17、OBP18對(duì)多種植物揮發(fā)物尤其是β-紫羅蘭酮有高的親和力[11];綠盲蝽(Apolygus lucorum)的 3 種 OBP(OBP3、OBP4、OBP6)和一種化學(xué)感受蛋白CSP1對(duì)植物揮發(fā)物沒(méi)有親和力,但對(duì)大部分次生代謝產(chǎn)物均有較高的親和力[12];樟巢螟(Orthaga achatina)OBP2對(duì)植物揮發(fā)物法尼醇和法呢烯有高的親和力[13];華北大黑鰓金龜?shù)?種OBP(OBP1、OBP2)均對(duì)植物揮發(fā)物有高的親和力[14]。

    本試驗(yàn)克隆蓮草直胸跳甲OBP51全長(zhǎng)cDNA序列,分析其序列特征,并利用定量PCR分析其在成蟲(chóng)不同組織中的相對(duì)表達(dá)量,旨在了解OBP51在蓮草直胸跳甲氣味識(shí)別過(guò)程中的作用,為進(jìn)一步揭示蓮草直胸跳甲專一取食喜旱蓮子草的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    蓮草直胸跳甲蟲(chóng)源來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)種群,在人工氣候箱中飼養(yǎng)完成,飼養(yǎng)溫度為25~27℃,光照條件為光照∶黑暗=14 h∶10 h,濕度為85%。取食的喜旱蓮子草為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全與生物防治實(shí)驗(yàn)室溫室中常年種植。

    PhusionRHigh-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自NEB(伊普斯威奇,英國(guó));M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega(麥迪遜,美國(guó));PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

    1.2 OBP51全長(zhǎng)基因克隆

    表1 研究所用引物

    取30頭化蛹3 d的蓮草直胸跳甲成蟲(chóng)觸角,液氮研磨后用 TRIzol提取總 RNA;取 1 μg總RNA,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用PhusionHigh-FidelityDNA Polymerase進(jìn)行全長(zhǎng)序列擴(kuò)增,PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μL,5×反應(yīng)緩沖液 4 μL,引物 OBP51-F/R(表 1)各 1 μL,dNTP 0.5 μL,DNA 聚合酶 0.2 μL,去離子水 12.3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃20 s,35個(gè)循環(huán);72℃5 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行切膠回收,連接到pEASY克隆載體后送至生工公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序無(wú)誤的單克隆加甘油后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 OBP51序列分析

    使用NCBI的ORF Finder進(jìn)行ORF預(yù)測(cè),使用SignalP 5.0分析信號(hào)肽,使用COBALT進(jìn)行多序列比對(duì),使用Compute pI/Mw計(jì)算等電點(diǎn)與分子量,使用ExPASy ProtParm進(jìn)行蛋白質(zhì)理化特性分析,使用PSIPRED預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)[15];采用Mega 7.0的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),其中,boot strap為1 000次。

    1.4 OBP51組織表達(dá)分析

    取化蛹后3 d的蓮草直胸跳甲成蟲(chóng)觸角、頭、胸、腹、后足、翅,分別提取總RNA,用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser去基因組并反轉(zhuǎn)后保存于-20℃?zhèn)溆谩J褂肁BI7500進(jìn)行定量PCR,體系(20 μL)為:2×TBGreenTMPremixExTaqTMII(Tli RNaseH Plus)10 μL,引物 OBP51-qF/qR(表 1)各1 μL,模板1μL。反應(yīng)條件為95℃3min;95℃30s,58℃30 s,72 ℃ 30 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。60~95℃進(jìn)行融解曲線分析。采用雙ΔCt法計(jì)算OBP51的相對(duì)表達(dá)量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 OBP51基因克隆及分析

    經(jīng)PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè),得到約400 bp的特異條帶,隨后克隆和測(cè)序,獲得OBP51的cDNA全長(zhǎng)為 489 bp(圖 1),其中,5′UTR 34 bp,ORF 411 bp,3′UTR 44 bp,編碼 136 個(gè)氨基酸;經(jīng) Blast比對(duì),其與多種其他昆蟲(chóng)OBP均具有高的相似性,其中,與大紅葬甲(Nicrophorus vespilloides)OBP56a最高,為40.52%。初步確定該基因?yàn)闅馕督Y(jié)合蛋白,并命名為AhygOBP51。

    2.2 OBP51序列分析

    信號(hào)肽分析表明,AhygOBP51含有18個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽,成熟蛋白為118個(gè)氨基酸,分子量為13.06ku,等電點(diǎn)為4.83,為酸性蛋白。含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基,缺少Classic OBP特征模式C1X24-29C2X3C3X22-43C4X8-10C5X8C6中的C2和 C5,為 Minus-C 型 OBP。賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、蘇氨酸(Thr)含量均高于 10%,分別為11.9%,11.9%,11.0%和10.2%。不含精氨酸、色氨酸和酪氨酸??偲骄杷?0.477,不穩(wěn)定系數(shù)40.52,脂肪族氨基酸指數(shù)74.41,表明AhygOBP51為脂溶性疏水蛋白,與氣味結(jié)合蛋白在觸角淋巴液的疏水環(huán)境是相符的。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,主要為α- 螺旋(helix),占 68.6%;其次為無(wú)規(guī)則卷曲,占28.8%。其符合氣味結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

    2.3 OBP51多序列比對(duì)和進(jìn)化分析

    將AhygOBP51與其他物種OBPs進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖2),除了含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基外,在C1與C3之間含有保守的苯丙氨酸(F),C4之后有更加保守的組氨酸(H),推測(cè)這些保守的氨基酸殘基可能與其定位或者運(yùn)輸氣味分子的功能密切相關(guān)。

    系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示(圖3),雖同為Minus-C型OBP,但被分為4個(gè)大分支,AhygOBP51與大紅葬甲(Nicrophorus vespilloides)OBP56a、56d、99a的進(jìn)化距離最近,與食糞金龜(Onthophagus taurus)OBP56d、大蠟螟(Galleria mellonella)OBP56d、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)OBP44等位于同一大分支上。

    2.4 OBP51表達(dá)分析

    采用定量PCR對(duì)OBP51在成蟲(chóng)不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析,結(jié)果顯示(圖4),在觸角中高表達(dá),在后足中也高表達(dá),且雄蟲(chóng)后足的表達(dá)量高于雌蟲(chóng)后足。OBP51在不同組織中的表達(dá)量大小為觸角≈后足>頭>翅>胸>腹。在觸角和后足中的高表達(dá)提示,其除了參與觸角對(duì)氣味分子的識(shí)別外,可能還參與后足的其他功能。

    3 結(jié)論與討論

    蓮草直胸跳甲作為入侵性雜草喜旱蓮子草的專食性天敵,在該惡性雜草的生物防治過(guò)程中占有重要的地位。本研究克隆得到蓮草直胸跳甲的AhygOBP51,具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基,模式符合Minus-COBPs家族的典型特征。Blast分析顯示,編碼蛋白與大紅葬甲(Nicrophorus vespilloides)OBP56a相似性最高,為40.52%;系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明,AhygOBP51與大紅葬甲(Nicrophorus vespilloides)OBP56a、56d、99a等聚為一支,表明其親緣關(guān)系較近,可能具有相似的功能。

    OBP基因最早被發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)于家蠶觸角中[16]。后來(lái)更多的研究發(fā)現(xiàn),OBPs主要在化學(xué)感受器官中表達(dá)[17],在翅、足中也表達(dá)。除了觸角,其他組織中也分布有大量的味覺(jué)、嗅覺(jué)感器,推測(cè)可能參與昆蟲(chóng)對(duì)寄主的定位[18-20]。組織表達(dá)分析顯示,AhygOBP51在后足、觸角中高表達(dá),這可能與昆蟲(chóng)能高效感受環(huán)境中各種氣味有關(guān)。除了觸角,OBP在足中高表達(dá)也在其他昆蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn),如茶尺蠖中多個(gè)OBP在足中高表達(dá)[21];同樣的結(jié)果也在大草蛉[22]、松褐天牛[23]、茄無(wú)網(wǎng)蚜[24]中被發(fā)現(xiàn),推測(cè)可能與感知寄主植物非揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān)[25-28],此推測(cè)有待進(jìn)一步證實(shí)。

    本試驗(yàn)成功克隆了蓮草直胸跳甲OBP51基因,并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析;熒光定量PCR分析顯示,該基因在觸角、足中高表達(dá),揭示其在蓮草直胸跳甲的化學(xué)感知過(guò)程中具有重要功能。后續(xù)擬開(kāi)展包括RNA干擾、熒光競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)等工作深入研究其功能。

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