正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)地鮮制法半夏工藝研究

金蓋宇，王海燕,李 娟,楊俊杰，熊之萍

中藥半夏來源為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的干燥塊莖。具有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)之功效[1]。生半夏有毒，內(nèi)服時(shí)需要炮制后才能入藥。法半夏是《藥典》規(guī)定品種，燥濕化痰力強(qiáng)，用于各類痰證?！端幍洹芬?guī)定的法半夏炮制方法非常籠統(tǒng)，對甘草和石灰水的比例和用量沒有明確要求，炮制時(shí)間也無詳細(xì)規(guī)定。因此，各地炮制的法半夏質(zhì)量參差不齊，療效有很大差別。文獻(xiàn)研究法半夏的主要指標(biāo)性成分為半夏總生物堿和甘草酸[2]。本試驗(yàn)直接采用產(chǎn)地新鮮半夏為原料，加輔料炮制制備法半夏，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以總酸(2015年版一部半夏含量測定項(xiàng)下指標(biāo))、總生物堿和甘草酸含量的綜合作用為指標(biāo)，對法半夏產(chǎn)地炮制方法進(jìn)行研究，并以草酸鈣針晶含量和家兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn)評價(jià)法半夏的炮制減毒作用，以期為法半夏的產(chǎn)地加工提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料、試劑和儀器

1.1 材料與試劑 新鮮半夏藥材購于信陽市息縣半夏種植基地，經(jīng)信陽農(nóng)林學(xué)院周巍教授鑒定為半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit的塊莖；甘草(亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號1505502)；琥珀酸對照品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號896-200001)；鹽酸麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號171241-200506)；甘草酸單銨鹽對照品(中國藥品生物制品檢驗(yàn)所，批號110731-9202)；草酸基準(zhǔn)試劑(購自河南省藥品檢驗(yàn)所)；純化水自制；甲醇為色譜純(天津四友)；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 L600-DP6高效液相色譜儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；ZD-3A型電位滴定儀(南京遠(yuǎn)拓)；梅特勒AB135-S電子分析天平(上海樹信儀器儀表有限公司)；SCQ-8201E超聲清洗儀(上海聲彥超聲波儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 大耳白種家兔，雌雄不限，體重(1.5±0.2)kg,雙眼正常，由信陽農(nóng)林學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 總酸的含量測定 樣品粉碎過四號篩，取粉末5g，精密稱定，加95%乙醇50mL,加熱回流1小時(shí)，過濾，再重復(fù)操作2次，合并濾液，蒸干。殘?jiān)尤?.1mol·L-1NaOH滴定液10mL溶解，超聲處理(功率500w,頻率40kHz)30 min，用蒸餾水定容至50mL。精密量取25mL，照電位滴定法(附錄ⅧA)測定，用鹽酸滴定液(0.1mol·L-1)滴定，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。根據(jù)有機(jī)酸消耗NaOH滴定液(0.1mol·L-1)的體積，計(jì)算有機(jī)酸含量。每1mL氫氧化鈉滴定液(0.1mol·L-1)相當(dāng)于5.904mg的琥珀酸(C4H6O8)[3]。

2.2 總生物堿的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品適量，用氯仿溶解，制得濃度為0.0632mg·mL-1的對照品溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10、12mL置于分液漏斗中，分別加蒸餾水10mL，pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液10mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液1mL，充分振蕩，放置30min，取氯仿層作為供試樣品。另取1mL水用同樣方法制備空白對照液。在417nm波長測定吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為A=0.1548C+0.0057，r=0.9996(n=6)，表明鹽酸麻黃堿在9.72～32.97μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3 供試品溶液的測定 取法半夏粉末5g,精密稱定，置于50mL三角瓶中，加入12%氨水適量，將樣品攪拌至濕潤，加入氯仿100mL，浸泡12h，超聲提取40min，過濾，殘?jiān)?0mL氯仿分3次洗滌，合并濾液與洗液，用氯仿稀釋至刻度，搖勻，取提取液10mL，濃縮至干，加入pH6.0緩沖液5mL，氯仿10mL，0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液1mL，充分振蕩，移至50mL分液漏斗，靜置30min，分取氯仿層，在417nm波長測定吸光度，計(jì)算，即得[4]。

2.3 甘草酸含量測定

2.3.1 色譜條件 PM952505-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；以甲醇-乙酸銨(0.2mol·L-1)-冰醋酸(67∶33:1)為流動(dòng)相；檢測波長為250nm。

2.3.2 對品溶液的制備 精密稱取甘草酸單銨鹽對照品適量，用流動(dòng)相配制成0.3mg·mL-1的對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液制備 稱取法半夏1g，精密稱定，置25mL錐形瓶中，加流動(dòng)相8mL，超聲處理1h，放冷，置于10mL容量瓶，用流動(dòng)相定容。

2.3.4 測定法 分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，即得[5]。

2.4 炮制工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 因素-水平表 以總酸、總生物堿和甘草酸含量為指標(biāo)，以L9(34) 正交表進(jìn)行設(shè)計(jì)，對甘草：石灰、炮制溫度、炮制時(shí)間和浸液pH進(jìn)行考察。因素-水平見表1。

表1 因素-水平表

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 取半夏鮮藥材200 g，按正交表中炮制方法制得法半夏，測定總酸、總生物堿和甘草酸含量。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

綜合分=(X/Xmax)×35%+(Y/Ymax)×35% +(Z/Zmax)×40% X:總酸含量 Y：總生物堿含量 Z：甘草酸含量

對正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，可知各因素影響的主次順序?yàn)椋焊什荩菏?炮制時(shí)間>浸液pH>炮制溫度。在考察范圍內(nèi)，炮制工藝的最佳條件可選擇為：A3B2C1D1。

表3為方差分析結(jié)果，由F值可知甘草、石灰用量比有顯著性影響。結(jié)合實(shí)際，確定炮制方法為：甘草：石灰比例15:10，炮制時(shí)間為2d，pH值為12，炮制溫度為30℃。

表3 方差分析表

2.5 法半夏毒性試驗(yàn)

2.5.1 對照藥材制備 取同批鮮半夏，置烘箱50℃干燥，干燥品即為生半夏。取生半夏按照藥典規(guī)定方法進(jìn)行加工，干燥，得到藥典法半夏品。

2.5.2 草酸鈣針晶含量測定 色譜條件：ODS-C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相0.5%KH2PO4-0.5mmol/L TBA水溶液(pH=2.0),以磷酸調(diào)節(jié)pH值，檢測波長254nm。

對照品溶液制備 精密稱取草酸對照品適量，用蒸餾水配制成濃度為0.2mg/mL的對照品溶液，即得。

供試品溶液制備 分別精密稱取生半夏、優(yōu)選法半夏和藥典法半夏粉末(60目)各0.1g，置玻璃容器中，加入3mL蒸餾水混勻，振蕩5min，置60℃水浴加熱并攪拌10min，3000r·min-1，離心5min,殘?jiān)詿峒兯礈?次，每次2mL，混勻離心，取藥材殘?jiān)?，?.2mL HCl(1:1)溶液，3.0mL純水混勻，置70℃水浴，邊攪拌邊加熱10min，離心(條件同上)，分離沉淀于上清液，沉淀用0.1mol·L-1HCl，同上法處理2次，每次2mL，離心，合并上清液，置10mL量瓶，純水定容至刻度，即得。

測定分別精密吸取對照品溶液10μL與供試品溶液5～10μL，注入液相色譜儀，測定，即得[6]。

將所得數(shù)據(jù)用SPSS23.0軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果如表4所示。

表4 草酸鈣針晶含量試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，優(yōu)選法半夏和藥典法半夏都能顯著降低刺激性成分草酸鈣針晶的含量，而優(yōu)選法半夏和藥典法半夏之間的草酸鈣針晶含量差別不明顯。

2.5.3 家兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn) 取家兔隨機(jī)分組，將20%生半夏混懸液、20%優(yōu)選法半夏混懸液、20%藥典法半夏混懸液分別滴入兔左右眼中，每組樣品用兔眼6只，每只眼給藥兩滴。給藥后，閉合眼瞼5～10s，2min后立即用40～50mL生理鹽水沖洗眼睛至眼中無任何異物，隨后1.5～3h內(nèi)觀察兔眼情況，根據(jù)刺激情況打分[6]。將所得數(shù)據(jù)用SPSS23.0軟件進(jìn)行處理，進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果如表5。

表5 家兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn)(n=6)

由表5可以看出，優(yōu)化法半夏和藥典法半夏與生半夏比較均可以顯著降低半夏的刺激性，二者差別不大。

3 討 論

關(guān)于法半夏加工方法的研究，到目前為止尚未見到產(chǎn)地鮮制法半夏的報(bào)道，本研究填補(bǔ)這方面的空白。本試驗(yàn)以正交試驗(yàn)表設(shè)計(jì)產(chǎn)地鮮制法半夏的炮制工藝，對加工過程中生石灰、甘草用量比、炮制溫度、炮制時(shí)間和浸液pH值進(jìn)行考察，并采用綜合評分和方差分析進(jìn)行工藝優(yōu)選。得到產(chǎn)地鮮制法半夏的炮制工藝為：室溫，每100g鮮半夏，用甘草15g,生石灰10g，浸泡2d，保持浸液pH12以上。較藥典法顯著縮短了加工時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，并量化了各工藝參數(shù)，為法半夏的產(chǎn)地加工提供技術(shù)指導(dǎo)。但干燥方法或干燥溫度是否影響法半夏中有效部位含量和法半夏質(zhì)量，還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)還評價(jià)了優(yōu)化法半夏的炮制減毒作用，結(jié)果表明用本試驗(yàn)確定的優(yōu)化法半夏較生半夏，草酸鈣針晶含量顯著降低，家兔眼結(jié)膜刺激性試驗(yàn)中刺激程度也顯著減??；與藥典法半夏比較，草酸鈣針晶含量和家兔眼結(jié)膜刺激性一致，同樣達(dá)到了減毒的目的。

本研究確定的法半夏加工方法操作簡單，對加工設(shè)備、技術(shù)要求低，易于普及，且法半夏飲片質(zhì)量重現(xiàn)性良好，可為有關(guān)部門制定法半夏飲片炮制品標(biāo)準(zhǔn)提供參考。