大鼠早期急性胰腺炎外周血及胰腺組織中PTEN表達(dá)水平及其意義的研究

張高峰，湯禮軍

急性胰腺炎是消化系統(tǒng)的常見疾病，常見病因有膽源性、高脂源性和酒精性，依據(jù)病情輕重可分為急性輕癥胰腺炎、中重度胰腺炎及急性重度胰腺炎。急性輕癥胰腺炎死亡率常較低，急性重癥胰腺炎目前死亡率仍然可達(dá)30-50%[1, 2]。對(duì)急性胰腺炎病情的早期評(píng)估有許多評(píng)分系統(tǒng)、影像學(xué)資料及生化資料。

PTEN(phosphatase and tensin)是1997 年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基因，PTEN 作為腫瘤抑制基因，對(duì)酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinases，RTK)、磷脂酰肌醇-3-激酶( phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) 、蛋白激酶B( protein kinase B，PKB又稱Akt)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)鍵作用。PTEN 在體內(nèi)可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響細(xì)胞生存、增殖和代謝，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。近年來許多的研究證明PTEN與免疫和炎性疾病有關(guān)系[4-6]。本實(shí)驗(yàn)就大鼠急性胰腺炎早期，PTEN在外周血水平及在胰腺組織中的表達(dá)做一研究。

1 材料與方法

1.1 模型的建立及分組 實(shí)驗(yàn)大鼠選用SPF級(jí)的8周齡雄性大鼠36只[簡(jiǎn)陽達(dá)碩動(dòng)物科技公司，SC XK(川)2004]，分為A組、B組和C組，每組12只。大鼠術(shù)前禁食12h，A組與C組用1.5%戊巴比妥鈉0.25ml/100g(上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司)麻醉大鼠后，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，做腹部正中切口開腹，找到胰腺后，用一次性靜脈輸液針(山東威高公司)從胰膽管自十二指腸開口處逆行穿刺進(jìn)入胰膽管，用微量注射泵(浙江浙大醫(yī)療設(shè)備有限公司)注射4%牛黃膽酸鈉(北京索萊寶科技有限公司)，C組大鼠在關(guān)腹前安置一根腹腔引流管，B組開腹后僅翻動(dòng)胰腺，不做藥物注射。

1.2 標(biāo)本采集 分別于手術(shù)后12小時(shí)、24小時(shí)兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)對(duì)三組大鼠采血并處死大鼠，取其胰腺。采血后以3000RPM離心5分鐘，取上清液，-80℃冰箱凍存。胰腺一部分立即置于液氮中，然后凍存于-80℃冰箱。剩余部分用生理鹽水簡(jiǎn)單清洗后固定于10%中性甲醛內(nèi)。

1.3 指標(biāo)的檢測(cè) 取上述血清，解凍后使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)淀粉酶及脂肪酶；血清中的PTEN蛋白的檢測(cè)，采用ELISA法，按照試劑盒說明書(武漢博士德生物工程公司)檢測(cè)血清中PTEN蛋白表達(dá)水平。對(duì)大鼠胰腺中的PTEN蛋白檢測(cè)是把標(biāo)本用10%中性甲醛固定后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、4um厚度切片；切片制作完成后進(jìn)行抗原的熱修復(fù)，按說明書加入一抗，4℃過夜，標(biāo)記二抗，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，光鏡下觀察切片，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒或團(tuán)塊為陽性細(xì)胞。HE染色是完成4um厚度切片后，依次過二甲苯2次、梯度酒精，蘇木素染色、分化、反藍(lán)、伊紅復(fù)染、過梯度酒精、二甲苯、中性樹脂封片，光鏡下進(jìn)行觀察并做病理評(píng)分。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠的淀粉酶和脂肪酶的比較 通過單因素方差分析 在造模后12小時(shí)和24小時(shí)，三組大鼠血清淀粉酶水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.73、45.75，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的淀粉酶均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組淀粉酶高于C組，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三組大鼠血清脂肪酶水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.72、46.46，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的脂肪酶均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A組脂肪酶高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1

表1 三組大鼠淀粉酶和脂肪酶比較

2.2 三組大鼠胰腺病理評(píng)分 胰腺的HE染色發(fā)現(xiàn)，在A組中，出現(xiàn)了大片胰腺腺泡的壞死、出血和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，而在C組中，胰腺表現(xiàn)為壞死程度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度較少一些，B組為并未出現(xiàn)胰腺充血、水腫、壞死(如圖1)。三組大鼠胰腺病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.73、28.5，P<0.05)；A組和C組均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，A組高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠胰腺病理評(píng)分

圖1 各組大鼠HE染色(HE×200)

2.3 三組大鼠胰腺組織PTEN檢測(cè)結(jié)果 用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PTEN蛋白在各個(gè)組之間的表達(dá)(圖2)，結(jié)果通過圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行分析，PTEN在三組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131、66，P<0.05)；在A、C組中，PTEN的表達(dá)(圖中棕黃色顆粒)高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05，A組的表達(dá)高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05

圖2 各組大鼠PTEN的表達(dá)(免疫組化×400)

組別nFNA組12h625512±3890*#A組24h626894±6013*#B組12h63292±999B組24h63379±703C組12h6 13064±1204*C組24h69693±1972* *與B組比較,P<0.05,#與C組比較,P<0.05

2.4 外周血中PTEN的檢測(cè)結(jié)果 通過單因素方差分析，在造模后12小時(shí)和24小時(shí)，三組大鼠血清PTEN水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.73、45.75，P<0.05)；通過LSD兩兩比較，A組和C組的血清PTEN蛋白均高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組PTEN高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳細(xì)結(jié)果見表4。

表4 外周血中PTEN檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

急性胰腺炎是消化系統(tǒng)的一種常見的急性炎癥，因?yàn)槠浞中偷牟煌?，預(yù)后的差別較大，干預(yù)和治療的措施也不同，所以早期對(duì)病情的預(yù)測(cè)顯得非常重要。目前對(duì)于AP早期的預(yù)測(cè)，較公認(rèn)的是一些評(píng)分系統(tǒng)，如急性生理和慢性健康狀況評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluationⅡ, APACHE Ⅱ)、Ranson評(píng)分、AP嚴(yán)重程度床邊指數(shù)評(píng)分(bedsideindex for severity in acute pancreatitis, BISAP)[7]與CTSI[8]評(píng)分等。這些評(píng)分系統(tǒng)對(duì)AP早期病情的評(píng)估有較大幫助，但他們各自的局限性也不能忽略。如Ranson評(píng)分需入院后48小時(shí)才能完成，可能會(huì)錯(cuò)過干預(yù)治療的黃金時(shí)機(jī)；APACHE Ⅱ評(píng)分項(xiàng)目太過復(fù)雜，臨床運(yùn)用是有一定局限性；CTSI評(píng)分則依賴于設(shè)備，同時(shí)某些患者對(duì)造影劑過敏也影響其在臨床上的運(yùn)用。因此，對(duì)于AP早期預(yù)測(cè)的因素也一直未停止探索。

PTEN在腫瘤的相關(guān)研究中較多，PTEN可影響細(xì)胞的增殖代謝，抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，PTEN在細(xì)胞的周期的生命活動(dòng)中有重要的作用，對(duì)目前研究腫瘤的相關(guān)治療有重要的意義[9]。近年來，也有許多研究表明PTEN與炎癥有關(guān)。在炎癥反應(yīng)中，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的趨化需要PI3K的調(diào)節(jié)，而抑制PI3K就能抑制微生物產(chǎn)物、炎性產(chǎn)物和許多趨化因子對(duì)白細(xì)胞趨化的誘導(dǎo)，而PTEN可負(fù)性調(diào)控PI3K，從而在炎癥反應(yīng)調(diào)控中起到重要的作用[9, 10]。在細(xì)胞免疫與體液免疫方面，PTEN也與許多調(diào)節(jié)有關(guān)[6, 11, 12]。正是基于PTEN與炎癥之間的關(guān)系較為密切，因此本實(shí)驗(yàn)選擇PTEN作為研究對(duì)象。

在本實(shí)驗(yàn)中，A組和C組早期的淀粉酶、脂肪酶明顯高于B組,胰腺病理評(píng)分也明顯高于對(duì)照組，因此對(duì)急性胰腺炎造模是成功的；本團(tuán)隊(duì)既往有實(shí)驗(yàn)證實(shí)急性胰腺炎早期行腹腔置管引流能明顯改善急性胰腺炎癥的情況；本次實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)早期置管引流后，C組的胰腺病理評(píng)分明顯低于B組。

在本實(shí)驗(yàn)中，PTEN表達(dá)在A組和C組明顯高于B組,PTEN在急性炎癥早期即有變化，對(duì)急性胰腺炎早期的預(yù)測(cè)可能有一定的幫助。許多文獻(xiàn)都傾向于PTEN是一個(gè)炎癥的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，但在本實(shí)驗(yàn)中，在胰腺病理評(píng)分較高的組別，PTEN的表達(dá)相對(duì)較高，在胰腺病理評(píng)分較低的組別反而表達(dá)更低。當(dāng)然，也有文獻(xiàn)報(bào)道，PTEN在巨噬細(xì)胞也具有調(diào)節(jié)作用，但并非簡(jiǎn)單的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，具有兩面性，不同巨噬細(xì)胞刺激因子導(dǎo)致其作用不盡相同，具體機(jī)制尚未闡明。目前PTEN是否參與了急性胰腺炎早期的炎癥調(diào)節(jié)、在哪里環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PTEN可能作為大鼠急性胰腺炎病情嚴(yán)重程度早期預(yù)測(cè)的指標(biāo)。