測(cè)定ClO-的水溶性熒光探針的合成及應(yīng)用

杜俊莉,李小露,任 帆,吳少平

(西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/糖生物學(xué)及藥物化學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室,陜西 西安 710069)

香豆素 (coumarin) 類化合物是廣泛存在于自然界的天然雜環(huán)化合物,其基本骨架為苯并α-吡喃酮 (如圖1)。其具有很多獨(dú)特的藥理活性,比如:抗病毒[1]、抗菌[2]、抗血管硬化[3]以及抗癌[4-5]等,是最早發(fā)現(xiàn)具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)之一。香豆素母核結(jié)構(gòu)本身不呈現(xiàn)熒光特性,但經(jīng)適當(dāng)結(jié)構(gòu)修飾后的香豆素衍生物,產(chǎn)生強(qiáng)的熒光特性[6-8]。香豆素衍生物具有熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大、光穩(wěn)定性好、細(xì)胞毒性小、對(duì)生物組織的損害小等優(yōu)點(diǎn)[9],因此,以香豆素類化合物為母體的熒光探針的合成及其相關(guān)應(yīng)用成為近年來一個(gè)新興的研究熱點(diǎn)。

圖1 香豆素類熒光化合物結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of coumarin fluorescent compounds

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是一類存在于生物體內(nèi)典型的氧的單電子還原產(chǎn)物[10],一般是對(duì)機(jī)體內(nèi)或天然環(huán)境中由氧組成,含氧且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。次氯酸(HClO)/次氯酸鹽(ClO-)是眾多活性氧(ROS)中最重要的一種[11],它是由活性有機(jī)體中的髓過氧化物酶(MPO)催化過氧化氫和氯離子產(chǎn)生的。過量可導(dǎo)致組織損傷,引發(fā)多種疾病,如:關(guān)節(jié)炎、腎臟疾病、肺損傷、心血管疾病及癌癥等[12-19]。但是，由于其反應(yīng)活性強(qiáng)、存在壽命短等特點(diǎn),對(duì)它的檢測(cè)仍然是目前的研究熱點(diǎn)。因此,我們?cè)谇捌谘芯康幕A(chǔ)上[20-21],利用香豆素?zé)晒馓结樀膬?yōu)點(diǎn),在香豆素類化合物上引入對(duì)甲氧基苯酚識(shí)別基團(tuán),設(shè)計(jì)合成了一個(gè)新穎的熒光探針HMAT。在探針HMAT中,香豆素?zé)晒鈭F(tuán)與受體單元對(duì)甲氧基苯酚之間存在PET效應(yīng),對(duì)熒光有強(qiáng)的淬滅作用;但當(dāng)受體與客體結(jié)合,即對(duì)甲氧基苯酚被ClO-氧化成醌式結(jié)構(gòu)以后,PET效應(yīng)受到抑制,香豆素?zé)晒鈭F(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,探針HMAT具有水溶性好、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)、響應(yīng)速度快、線性關(guān)系良好、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。同時(shí),探針HMAT具有細(xì)胞毒性低、細(xì)胞膜透過性良好和生物相容性好的特性,在神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y中取得了良好的熒光成像效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光分光光度計(jì)(F-7000,日立高新技術(shù)公司),紫外可見分光(UV-2550,日本島津),超導(dǎo)核磁共振儀 (6001541ASP,VARIAN公司),電離飛行質(zhì)譜儀(MALDI-TOFMass Spectrometer),激光共聚焦顯微鏡(OlympusFV-1000,日本Olympus公司),三用紫外分析儀(ZF-C型,上?？岛坦怆妰x器有限公司),電子天平(BSA124S,賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

乙酰乙酸乙酯(141-97-9,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑),哌啶(110-89-4,麥克林試劑),2-羥基-5-甲氧基苯甲醛(672-13-9,麥克林試劑)。

1.2 探針HMAT的合成

以8-羥基四氫吡啶并喹啉-9-甲醛為原料,和乙酰乙酸乙酯,哌啶在乙醇中回流5 h,合成香豆素類化合物2,以化合物2為骨架,通過與2-羥基-5-甲氧基苯甲醛在甲苯中回流72 h,連接識(shí)別基團(tuán)來得到探針HMAT，如圖2所示，用來檢測(cè)ClO-。

圖2 探針HMAT的合成Fig.2 Probe HMAT

1.2.1 化合物2的合成 稱取化合物1 (200.0 mg) 置于25 mL圓底燒瓶中,加入10 mL無水EtOH,隨后將乙酰乙酸乙酯 (174 μL),哌啶 (200 μL)加入圓底燒瓶中,混合液在85℃回流5 h,蒸干溶劑,殘?jiān)肰(PE)∶V(EtOAc)=4∶1作為洗脫液硅膠柱層析得到純化合物2 (收率:93%,Rf=0.12,V(PE)∶V(EtOAc)=4∶1)。1H NMR (600 MHz, CDCl3)δ: 8.31 (s, 1H), 6.94 (s, 1H), 3.33 (dd,J=11.6, 6.2 Hz, 4H), 2.86 (t,J=6.2 Hz, 2H), 2.74 (d,J=5.9 Hz, 2H), 2.65 (s, 3H), 1.96 (d,J=5.2 Hz, 4H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3)δ: 195.97, 161.25, 153.75, 148.75, 147.89, 127.76, 119.53, 114.81, 108.03, 105.59, 50.33, 49.93, 30.79, 27.41, 21.11, 20.64, 20.10。

1.2.2 探針HMAT的合成 稱取化合物2 (100 mg), 2-羥基-5-甲氧基苯甲醛 (80.6 mg)置于25 mL圓底燒瓶中, 加入10 mL無水甲苯, 后加入100 μL哌啶, 反應(yīng)混合物在110 ℃回流72 h。 反應(yīng)結(jié)束后, 沉淀過濾, 用V(DCM)∶V(MeOH)=30∶1作為洗脫液硅膠柱層析得到純探針HMAT (收率:31%,Rf=0.28,v(DCM)∶v(MeOH)=20∶1。HRMS (C25H23NO5): calcd. for [M+H]+418.165 4; found: [M+H]+418.164 1。

1.3 實(shí)驗(yàn)樣品的制備

探針HMAT標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1.0 mmol/L)的配制:準(zhǔn)確稱取10.4 mg探針HMAT于25 mL容量瓶中,用DMF定容至刻度線,備用。

ClO-標(biāo)準(zhǔn)溶液 (1.0 mmol/L)的配制:準(zhǔn)確量取84.5 μL 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaClO溶液于50 mL容量瓶中,用超純水定容至刻度線,備用。

PBS緩沖液 (0.1mol/L, pH 7.4)的配制:準(zhǔn)確稱取0.270 0 g磷酸二氫鉀 (KH2PO4),1.420 0 g磷酸氫二鈉 (Na2HPO4),8.000 0 g氯化鈉 (NaCl),0.200 0 g氯化鉀 (KCl),混合后加超純水約800 mL充分?jǐn)嚢枞芙?調(diào)pH到7.4,定容到1 L,備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針HMAT與ClO-反應(yīng)的光譜特性

首先,我們研究了探針HMAT與不同濃度ClO-反應(yīng)的紫外吸收光譜變化 (圖3)。可以看出,探針本身在450 nm處有強(qiáng)的紫外吸收,隨著ClO-濃度的增加 (0～20 μmol/L),體系的紫外吸收強(qiáng)度逐漸降低,后逐漸達(dá)到平衡狀態(tài)。體系的吸收強(qiáng)度在0～6 μmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.986 2)。

圖3 探針HMAT與不同濃度ClO-反應(yīng)的吸收光譜及工作曲線Fig.3 Working curve and UV-vis spectra of probe HMAT (10 μmol/L) upon the addition of 0～20 μmol/L ClO-

其次,研究了探針HMAT與ClO-反應(yīng)的熒光光譜(圖4)?？梢钥闯?探針HMAT本身有弱的熒光信號(hào)(λex=450 nm,λem=500 nm),當(dāng)加入ClO-以后,探針在490 nm處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)(λex=440 nm),其熒光強(qiáng)度增加13倍。

圖4 探針HMAT與ClO-反應(yīng)的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of probe HMAT reaction with ClO-

最后,研究了探針HMAT與不同濃度ClO-反應(yīng)的熒光光譜變化,如圖5所示,探針本身在500 nm處有微弱的熒光信號(hào),當(dāng)ClO-的濃度 (0～9 μmol/L) 逐漸增大的時(shí)候,探針的發(fā)射波長發(fā)生藍(lán)移,在490 nm處的熒光強(qiáng)度顯著增加。隨后,當(dāng)ClO-濃度增加的時(shí)候,體系的熒光強(qiáng)度達(dá)到平衡狀態(tài)。體系的熒光響應(yīng)與ClO-濃度在1.0～9.0 μmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2=0.993 2),最低檢出限為1.3 nmol/L。

2.2 動(dòng)力學(xué)研究

因?yàn)樯矬w內(nèi)活性氧反應(yīng)活性強(qiáng)、存在壽命短,因此發(fā)現(xiàn)一種可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、快速監(jiān)測(cè)活性氧變化的方法是非常重要的。為此,我們檢測(cè)了探針HMAT對(duì)ClO-的響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)情況 (圖6a),在沒有加入ClO-時(shí),探針HMAT呈現(xiàn)弱熒光信號(hào),而且熒光信號(hào)不隨時(shí)間改變而改變,而加入20 μmol/L ClO-后,發(fā)現(xiàn)490 nm處的熒光強(qiáng)度迅速顯著增強(qiáng), 隨后基本不隨時(shí)間的變化而變化。這表明探針HMAT具有對(duì)ClO-響應(yīng)速度快(瞬時(shí)響應(yīng))、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

生理狀態(tài)下,正常組織細(xì)胞外pH值介于7.2～7.4之間,但是,惡性腫瘤組織細(xì)胞外pH值介于6.5～6.9之間。因此,我們要評(píng)估探針HMAT在不同pH范圍內(nèi)對(duì)響應(yīng)程度,看它能否應(yīng)用于惡性腫瘤組織中。在pH 3.0～14.0的范圍內(nèi),研究了探針和加入ClO-后的熒光信號(hào)的變化 (圖6b),在未加入ClO-時(shí),探針HMAT在pH 3.0～14.0范圍內(nèi)熒光信號(hào)未發(fā)生明顯變化。這說明探針本身在pH 3.0～14.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。當(dāng)加入ClO-后,體系的熒光強(qiáng)度在pH 3.0～14.0范圍內(nèi)也基本沒有發(fā)生變化。以上結(jié)果表明,探針HMAT本身以及與ClO-反應(yīng)后都對(duì)pH變化具有廣泛的耐受性。

圖5 探針HMAT與不同濃度ClO-反應(yīng)的熒光光譜及工作曲線Fig.5 Working arve and Fluorescence spectra of probe HMAT (10 μmol/L) upon the addition of 0～20 μmol/L ClO-

2.3 選擇性研究

為了研究探針HMAT與ClO-之間的選擇性,實(shí)驗(yàn)測(cè)定了探針HMAT與一些生物活性相關(guān)的物質(zhì),如活性氧(ROS)、活性硫(RSS)、活性氮(RNS)、陰離子和陽離子等相互作用的熒光光譜 (圖7a)。只有在加入ClO-后,體系在490 nm處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)。隨后,我們又檢測(cè)了探針HMAT對(duì)其他分析物的抗干擾能力(圖7b)?？梢钥闯?其他分析物都不會(huì)干擾ClO-的檢測(cè)。這些結(jié)果表明探針HMAT對(duì)ClO-的測(cè)定具有很好的選擇性,不受其他干擾物質(zhì)的影響,使其能夠在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中專一的檢測(cè)ClO-,并且可以裸眼觀測(cè)。

2.4 反應(yīng)機(jī)理探討

在探針HMAT中,香豆素?zé)晒鈭F(tuán)與識(shí)別基團(tuán)對(duì)甲氧基苯酚之間存在PET效應(yīng),對(duì)熒光有強(qiáng)的淬滅作用。但是，當(dāng)受體與客體結(jié)合,即對(duì)甲氧基苯酚被ClO-氧化成醌式結(jié)構(gòu)以后,PET效應(yīng)受到抑制,香豆素?zé)晒鈭F(tuán)就會(huì)發(fā)射熒光，如圖8所示。

2.5 生物應(yīng)用研究

在光學(xué)研究的基礎(chǔ)上,我們又對(duì)探針HMAT的生物應(yīng)用進(jìn)行了研究。探針HMAT對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的細(xì)胞毒性結(jié)果表明(圖9),當(dāng)探針濃度高達(dá)25 μmol/L時(shí),SH-SY5Y細(xì)胞的存活率依然可以達(dá)到80%以上,說明探針對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞幾乎沒有毒性。

圖6 探針HMAT與CLO-反應(yīng)的時(shí)間及pH影響Fig.6 Working pH and Time-response of HMAT with ClO-

圖7 探針HMAT對(duì)ClO-的選擇性和競爭性Fig.7 The selectivity and compctition of fluorescence spectra of HMOT

圖8 探針HMAT與ClO-的反應(yīng)機(jī)理Fig.8 Reaction mechanism of probe HMAT with ClO-

圖9 探針HMAT的細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)Fig.9 Cytotoxicity assays of probe HMAT at different concentrations for SH-SY5Y neuroblastoma cells

在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)探針HMAT (10 μmol/L) 進(jìn)行了SH-SY5Y細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，如圖10所示?？梢钥闯觯结槺旧碓诰G色通道 (430～490 nm) 下有微弱的熒光信號(hào),當(dāng)加入20 μmol/L ClO-后,細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。上述結(jié)果證明,探針HMAT具有在活細(xì)胞中可視化檢測(cè)ClO-的能力。

圖10 探針HMAT在SH-SY5Y細(xì)胞中熒光成像實(shí)驗(yàn)Fig.10 Fluorescence image of SH-SY5Y neuroblastoma cells incubated with probe HMAT

3 結(jié) 論

本文成功設(shè)計(jì)合成了一種基于香豆素骨架的熒光探針HMAT,在加入ClO-之前,探針在500 nm處有微弱的熒光信號(hào),但加入ClO-后,探針在490 nm處的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng),反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度與ClO-濃度在1.0～9.0 μmol/L內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,探針HMAT具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾強(qiáng)、響應(yīng)速度快、線性關(guān)系良好、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。此外,探針HMAT具有水溶性好、細(xì)胞毒性低、細(xì)胞膜透過性良好和生物相容性好的特性。細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)表明,探針HMAT可以有效實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)ClO-的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、可視監(jiān)測(cè),為生命體中ClO-的快速檢測(cè)提供了技術(shù)支撐,亦可為疾病的早期診斷與治療提供一定的參考價(jià)值。