自動(dòng)化p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色在宮頸癌篩查中的價(jià)值

李歡歡 李肖甫 智艷芳 榮守華 李雅 樊婷婷 杜沛霈

宮頸癌是女性癌癥患者死亡的第二大原因，尤其在20～39歲年齡段表現(xiàn)更為突出，僅次于乳腺癌。因此，多數(shù)學(xué)者強(qiáng)調(diào)提高該年齡段人群篩查率，同時(shí)增加人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）疫苗接種率［1］。宮頸癌是目前唯一能夠經(jīng)早期篩查被發(fā)現(xiàn)，并通過醫(yī)學(xué)干預(yù)使發(fā)病率和病死率降低的婦科惡性腫瘤，其中手術(shù)治療是早期宮頸癌的最佳選擇，臨床分期、腫瘤分化程度、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是影響手術(shù)治療預(yù)后的重要因素［2］。目前有研究已證實(shí)，高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)病變和宮頸癌的主要原因［3］，而早期發(fā)現(xiàn)和治療宮頸癌前病變的關(guān)鍵在于進(jìn)行宮頸癌篩查。然而細(xì)胞學(xué)檢查的敏感度較低，HPV檢測(cè)的特異度較低，導(dǎo)致臨床不必要的轉(zhuǎn)診和治療，增加了患者的心理負(fù)擔(dān)和醫(yī)療保健的成本。

目前已發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌的形成過程中伴隨著p16INK4a表達(dá)上調(diào)，宮頸癌前病變與p16INK4a蛋白過度表達(dá)密切相關(guān)。2012年下生殖道相關(guān)鱗狀上皮病變命名標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（the lower anogenital squamous terminology standardization，LAST）和2014年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）均建議將p16INK4a過度表達(dá)作為判斷高度鱗狀上皮內(nèi)病變（high-grade squamous intraepitheial lesion，HSIL）或?qū)m頸癌的重要指標(biāo)［4-5］。對(duì)于宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）2級(jí)病例，應(yīng)用p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色區(qū)分HSIL和低度鱗狀上皮內(nèi)病變（low-grade squamous intraepitheial lesion，LSIL），而不能僅以形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒別。目前，p16INK4a染色在組織學(xué)中應(yīng)用較普遍，而細(xì)胞學(xué)的相關(guān)報(bào)道較少，且大多采用手工染色，技術(shù)方法和結(jié)果判讀無固定標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果相差較大。本研究選擇2017年9月—2018年11月在本院參加宮頸癌篩查的970例婦女作為研究對(duì)象，利用統(tǒng)一細(xì)胞免疫標(biāo)記染色全自動(dòng)儀器進(jìn)行檢測(cè)，旨在通過大樣本臨床試驗(yàn)驗(yàn)證p16INK4a染色可提高宮頸癌前病變?cè)\斷的準(zhǔn)確性，降低誤診率和漏診率，從而提高臨床治療效果。

1 資料與方法

1.1 觀察對(duì)象 選擇2017年9月—2018年11月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦科門診和病房參加宮頸癌篩查，并同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)和HR-HPV檢測(cè)的1 100例婦女作為觀察對(duì)象，年齡20～65歲，中位年齡44歲；均為受試時(shí)未懷孕、無骨盆放射治療史的已婚婦女；細(xì)胞病理和組織病理兩項(xiàng)檢查時(shí)間間隔在1個(gè)月內(nèi)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有參與者均被告知詳細(xì)研究細(xì)節(jié)并知情同意。所有數(shù)據(jù)均經(jīng)處理，以保護(hù)患者隱私。

1.2 分組 將細(xì)胞學(xué)〔無明確診斷意義的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASC-US）及以上〕和 HR-HPV（14種高危型至少1種陽性）至少一項(xiàng)異常的婦女作為實(shí)驗(yàn)組，再根據(jù)細(xì)胞學(xué)及HR-HPV檢測(cè)結(jié)果分為A、B、C組，A組宮頸細(xì)胞學(xué)和HR-HPV均為陽性，B組宮頸細(xì)胞學(xué)陽性、HR-HPV陰性，C組宮頸細(xì)胞學(xué)陰性、HR-HPV陽性。細(xì)胞學(xué)和HR-HPV均為陰性，因其他婦科良性子宮疾病（如無生育要求而癥狀嚴(yán)重的子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病等）行子宮切除術(shù)的婦女作為對(duì)照組。

1.3 方法 受檢者均參加宮頸癌篩查，同時(shí)行細(xì)胞學(xué)和HR-HPV檢測(cè)，并留存細(xì)胞學(xué)標(biāo)本進(jìn)一步行自動(dòng)化p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色，追蹤組織學(xué)結(jié)果。

1.3.1 p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)自動(dòng)化染色 檢測(cè)p16INK4a蛋白在宮頸細(xì)胞學(xué)中的表達(dá)情況，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.1.1 儀器與試劑 自動(dòng)化統(tǒng)一細(xì)胞免疫標(biāo)記染色機(jī)、振蕩器、顯微鏡，p16試劑（Anti-CDKN2A/p16INK4a），均購自廣州江元醫(yī)療科技有限公司；抗體購自Abcam（Cambridge，MA，USA）；清洗液（分為A、B、C），緩沖液 PBS-X（10 s）、緩沖液 PBS-T（10 s），免疫顯色試劑（封閉液、P1液、P2液、抗體稀釋液、DAB顯色液、DAB稀釋液、質(zhì)控片），蘇木素染液。

1.3.1.2 結(jié)果判定 由兩位細(xì)胞診斷醫(yī)師評(píng)估認(rèn)定p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果。p16INK4a著色部位為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，染色呈黃色或棕黃色者為陽性，與背景幾乎相同者為弱陽性，細(xì)胞質(zhì)局限染色者為陰性。根據(jù)Wentzensen等［6］提出的4項(xiàng)核評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比增加、染色質(zhì)顆粒增多、核形態(tài)不規(guī)則、無核狀態(tài)）對(duì)p16INK4a陽性細(xì)胞進(jìn)行詳細(xì)評(píng)價(jià)，核評(píng)分＞2分為陽性。其中無p16陽性細(xì)胞者，評(píng)分0分；p16陽性細(xì)胞無任何核改變跡象，評(píng)分1分；僅表現(xiàn)上述標(biāo)準(zhǔn)之一的輕度核異常細(xì)胞，評(píng)分2分；細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比增加（＞50%），加另外1項(xiàng)陽性標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分3分；所有細(xì)胞的細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)比均增加，加另外至少2項(xiàng)陽性標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)分4分。根據(jù)p16陽性細(xì)胞的分布模式，將其進(jìn)一步分為片狀、斑片狀和單細(xì)胞3種類型。片狀細(xì)胞組由分布為片狀團(tuán)簇的細(xì)胞組成，大部分細(xì)胞呈陽性；斑片狀組由分布為交替簇的染色呈陽性或陰性的少數(shù)陽性細(xì)胞組成；單細(xì)胞組由單個(gè)陽性細(xì)胞組成［7］。

1.3.2 細(xì)胞學(xué)檢查 細(xì)胞學(xué)檢查采用ThinPrep 2000（美國Cytyc公司）液基薄層細(xì)胞自動(dòng)制片機(jī)制片，利用細(xì)胞學(xué)診斷后剩余標(biāo)本進(jìn)一步行細(xì)胞免疫標(biāo)記染色法檢測(cè)并另外制片。對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷不一致的病例進(jìn)行回顧性診斷分析，排除人為因素；由兩位高年資細(xì)胞病理醫(yī)師采用雙盲法診斷，兩者診斷結(jié)果一致方可納入統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)2014年修訂的TBS系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果判讀，分為ASC-US、LSIL、不能排除HSIL不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells-cannot exclude HIS，ASC-H）、HSIL、鱗狀細(xì)胞癌（squamous cell cancer，SCC）、未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM，包括霉菌、滴蟲感染）。

1.3.3 HR-HPV檢測(cè) 采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）+導(dǎo)流雜交法，試劑盒由PCR試劑、雜交試劑兩部分組成，應(yīng)用基因擴(kuò)增技術(shù)及導(dǎo)流雜交原理，以凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀為平臺(tái)，通過反向點(diǎn)雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物與包被有型特異性探針膜雜交結(jié)果。該方法可以檢測(cè)14種最常見高危型 HPV（HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68型）。試劑購自凱普生物科技有限公司，嚴(yán)格按說明書操作。根據(jù)HR-HPV感染類型分為HR-HPV陰性、其他12種HR-HPV陽性和HPV16/18陽性（HPV16型或HPV18型任一陽性）。

1.3.4 陰道鏡及組織病理學(xué)檢查 細(xì)胞學(xué)篩查異常者（如細(xì)胞學(xué)ASC-US伴HPV檢測(cè)陽性、兩次細(xì)胞學(xué)連續(xù)常規(guī)篩查均為ASC-US、細(xì)胞學(xué)為L(zhǎng)SIL及以上、HPV 16/18陽性），均行陰道鏡檢查和宮頸活檢。組織學(xué)診斷由本院3位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家進(jìn)行顯微鏡下組織學(xué)診斷，組織學(xué)活檢結(jié)果按2014年世界衛(wèi)生組織出版的《女性生殖器官腫瘤組織學(xué)分類（第4版）》［5］標(biāo)準(zhǔn)分為良性（無病理改變和良性或反應(yīng)性改變）、LSIL（CIN1和 p16陰性的 CIN2）、HSIL（p16陽性的CIN2、CIN3、原位癌或腺鱗癌）和SCC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p16INK4a染色與HR-HPV感染的關(guān)系采用非條件Logistic回歸分析，不同HR-HPV感染型和病理診斷的p16INK4a陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。對(duì)p16INK4a染色結(jié)果進(jìn)行診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)，計(jì)算敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 由于130例未追蹤到病理結(jié)果（部分細(xì)胞學(xué)ASC-US或?yàn)長(zhǎng)SIL，HR-HPV陰性者未做陰道鏡下活檢，部分失訪），最終970例婦女納入研究。其中625例細(xì)胞學(xué)檢查陰性，345例細(xì)胞學(xué)檢查陽性（ASC-US及以上級(jí)別）；434例HR-HPV陽性（14種高危型任一型陽性），536例HR-HPV陰性。

2.2 p16INK4a染色與HR-HPV感染的關(guān)系 HR-HPV總陽性率為44.74%（434/970），p16INK4a染色總陽性率為24.74%（240/970）。實(shí)驗(yàn)組HR-HPV陽性率為80.37%（434/540），其中A、B、C組p16INK4a染色陽性率分別為63.18%（151/239）、26.42%（28/106）、22.05%（43/195），A組較B、C組明顯升高（均P＜0.01），B組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。p16INK4a染色陽性時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的p16INK4a染色陽性率分別為92.50%（222/240）和7.50%（18/240），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 對(duì)照組以及不同TCT、HR-HPV檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組各組的p16INK4a染色陽性率

HR-HPV陰性組、其他12種HR-HPV陽性組和HPV16/18陽性組的p16INK4a陽性率依次為8.58%（46/536）、33.46%（86/257）、61.02%（108/177），呈遞增趨勢(shì)（χ2＝210.37，P＜0.01）。非條件Logistic回歸分析顯示，p16INK4a在其他12種HR-HPV陽性組和HPV16/18陽性組中的表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)均明顯高于HPV陰性組〔OR值分別為 5.36（95%CI＝3.60～7.98）、16.67（95%CI＝10.88～25.56），均P＜0.01〕。見表2。

表2 不同HR-HPV感染類型各組的p16INK4a染色陽性率

2.3 p16INK4a染色在不同細(xì)胞學(xué)診斷分級(jí)中的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的p16INK4a染色陽性率分別為41.11%（222/540）、4.19%（18/430）。970例受檢者中，NILM 625例（64.43%），ASC 201例（20.72%，ASC-US 120例和ASC-H 81例），LSIL 59例（6.08%），HSIL及以上85例（8.76%，HSIL 83例和SCC 2例），p16INK4a染色陽性率分別為9.76%、35.59%、43.28%、83.53%；細(xì)胞學(xué)異常組的p16INK4a染色陽性率為51.88%（179/345）。隨細(xì)胞學(xué)診斷級(jí)別升高，p16INK4a染色陽性率逐漸升高（χ2＝260.02，P＜0.01），且染色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。見表3，圖1。

表3 p16INK4a染色與細(xì)胞學(xué)之間的關(guān)系

圖1 p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色細(xì)胞（高倍放大）

2.4 p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與對(duì)應(yīng)細(xì)胞學(xué)及病理組織學(xué)的關(guān)系 對(duì)照組共納入430例，p16INK4a染色陽性率為4.19%（18/430）。良性組織病理組428例（包括濕疣樣變、慢性宮頸炎、宮頸息肉等），CIN2 2例；良性組織病理組和異常組織病理組p16INK4a染色陽性率分別為3.74%（16/428）、100%（2/2）。實(shí)驗(yàn)組共納入540例，良性372例，p16INK4a染色陽性率為20.16%（75/372）；LSIL 37例（包括CIN1 33例，p16陰性CIN2 4例），p16INK4a染色陽性率為54.05%（20/37）；HSIL組127例（包括p16陽性CIN2 39例，CIN3 88例），p16INK4a染色陽性率為96.85%（123/127）；SCC 4例，p16INK4a染色陽性率為100%（4/4）。

以組織學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，良性組p16INK4a染色陽性率為 11.38%（91/800），病理異常組 p16INK4a染色陽性率為87.65%（149/170），隨宮頸病變程度加重p16INK4a染色陽性率逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝428.20，P＜0.01）。HSIL組、SCC組的p16INK4a染色陽性率均明顯高于良性組和LSIL組（均P＜0.05）；HSIL組與SCC組之間的p16INK4a比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。4例SCC中，1例細(xì)胞學(xué)診斷為ASC-H，p16INK4a染色陽性；129例HSIL中，60例細(xì)胞學(xué)診斷與組織學(xué)診斷一致，p16INK4a染色陽性率為96.90%（125/129）；在診斷宮頸SCC和HSIL時(shí)，p16INK4a染色與細(xì)胞學(xué)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在LSIL和良性組中，p16INK4a染色與細(xì)胞學(xué)診斷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色與對(duì)應(yīng)細(xì)胞學(xué)及病理組織學(xué)的關(guān)系

2.5 p16INK4a、細(xì)胞學(xué)和HR-HPV檢測(cè)在宮頸HSIL+中的篩查價(jià)值 以組織學(xué)為金標(biāo)準(zhǔn)，p16INK4a染色診斷HSIL+的敏感度和特異度分別為96.99%和86.74%，均優(yōu)于HR-HPV檢測(cè)（90.98%、62.60%）和細(xì)胞學(xué)（86.47%、72.52%）。見表5。

表5 p16INK4a、細(xì)胞學(xué)和HR-HPV對(duì)HSIL+篩查的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值

3 討論

宮頸癌是婦科惡性腫瘤的常見癌癥之一，其產(chǎn)生原因?yàn)镠R-HPV持續(xù)感染，尤其以HPV 16型和18型最常見且風(fēng)險(xiǎn)最高。目前，宮頸癌篩查主要依賴宮頸脫落細(xì)胞學(xué)和HPV-DNA檢測(cè)，但上述兩種篩查方法均有局限性。細(xì)胞學(xué)檢查的敏感度較低、假陰性率較高，且細(xì)胞學(xué)醫(yī)師的培養(yǎng)過程漫長(zhǎng)；而HPV-DNA檢測(cè)雖敏感度有所提高，但特異性較差，不能確定HPV感染者的宮頸病變情況是否有進(jìn)一步發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。因此，當(dāng)務(wù)之急是尋找能夠預(yù)測(cè)宮頸病變發(fā)展趨勢(shì)的早期指標(biāo)或輔助診斷指標(biāo)，從而在病毒持續(xù)感染者中準(zhǔn)確找出宮頸癌高?；颊?，達(dá)到精準(zhǔn)防治腫瘤的目的，減輕患者心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

p16INK4a是位于染色體9p21上的CDKN2a腫瘤抑制基因編碼的蛋白質(zhì)，p16INK4a蛋白與CDK4/6結(jié)合并維持pRb處于低磷酸化狀態(tài)，后者又與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并阻止細(xì)胞增殖周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化和DNA合成的啟動(dòng)［8］。宮頸癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，HR-HPV持續(xù)感染是主要致病因素，可能的機(jī)制為當(dāng)宿主持續(xù)感染HR-HPV后，HR-HPV的DNA整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組，導(dǎo)致E6和E7病毒基因產(chǎn)生癌蛋白。E6降解p53，E7結(jié)合pRb并使其失活，導(dǎo)致pRb喪失對(duì)p16INK4a基因的負(fù)反饋抑制作用，p16INK4a蛋白呈過表達(dá)［9-12］，最終驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡。上述現(xiàn)象也可在一些正常細(xì)胞中觀察到，如衰老細(xì)胞、鱗狀化生細(xì)胞及萎縮細(xì)胞。

研究表明［13-14］，p16INK4a基因及其表達(dá)產(chǎn)物在大部分腫瘤組織中缺失或低表達(dá)，而在宮頸上皮內(nèi)病變及宮頸癌組織中的表達(dá)量和范圍則隨宮頸級(jí)別的升高而逐漸增加。p16INK4a被認(rèn)為是HR-HPV感染轉(zhuǎn)化的生物標(biāo)記物，p16INK4a陽性表達(dá)程度也可用于判斷HR-HPV感染程度，p16INK4a陰性表明病變處于非異型增生狀態(tài)，而p16INK4a陽性則表明病變處于異型增生相?？紤]到僅少數(shù)LSIL病例可進(jìn)展為更高級(jí)的病變，p16INK4a陽性可能對(duì)指導(dǎo)低風(fēng)險(xiǎn)的絕經(jīng)婦女和青少年患者進(jìn)行更密切的隨訪或進(jìn)一步評(píng)估有一定實(shí)用價(jià)值。迄今為止，已有研究提示p16INK4a作為一種生物標(biāo)志物在宮頸細(xì)胞學(xué)涂片中發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞的可行性［15-19］。目前p16INK4a染色在組織學(xué)中應(yīng)用較普遍，而在細(xì)胞學(xué)中報(bào)道較少，且?guī)缀蹙鶠槭止と旧旧珪r(shí)間長(zhǎng)短不一，操作人員水平良莠不齊，技術(shù)方法和結(jié)果判讀無固定標(biāo)準(zhǔn)，報(bào)道結(jié)果相差較大。本研究采用自動(dòng)化統(tǒng)一免疫標(biāo)記染色機(jī)，制片及染色步驟更標(biāo)準(zhǔn)化，避免了操作者差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，具有較好的可重復(fù)性和診斷準(zhǔn)確性。

本研究結(jié)果表明，p16INK4a在HR-HPV陽性人群中的表達(dá)高于HR-HPV陰性人群，且p16INK4a在HPV16/18陽性組中的表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)是其他12種HRHPV陽性組的3倍，與既往研究結(jié)果一致［20］，提示p16INK4a表達(dá)與HR-HPV感染有關(guān)。

Bergeron 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，p16INK4a診斷篩查人群 HSIL+的敏感度為 86%；Carozzi等［22］研究顯示，篩查人群中p16INK4a免疫染色的橫斷面敏感度為88%；本研究中p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色診斷HSIL+的敏感度為96.99%，特異度為86.74%（可能與具有良好形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)專家閱片有關(guān)），均高于HR-HPV和細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

本研究中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的p16INK4a染色陽性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然對(duì)照組出現(xiàn)少量p16INK4a染色陽性，但其核評(píng)分多集中在1～2分，而實(shí)驗(yàn)組則集中在3分及以上。細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)結(jié)果均顯示，隨宮頸病變程度加重，p16INK4a染色陽性率及核評(píng)分均明顯升高，說明p16INK4a染色程度與宮頸高級(jí)別病變的發(fā)生密切相關(guān)，p16INK4a染色評(píng)分越高，進(jìn)展為宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)越大。臨床工作中，由于HSIL的細(xì)胞形態(tài)和萎縮細(xì)胞有時(shí)非常相似，僅根據(jù)形態(tài)學(xué)進(jìn)行細(xì)胞診斷可能是一個(gè)挑戰(zhàn)，尤其當(dāng)萎縮細(xì)胞出現(xiàn)深色擁擠群（Hyperchromatic crowded groups，HCGs）細(xì)胞時(shí)很容易被誤認(rèn)為是HSIL。本研究800例良性病變中，69例僅通過細(xì)胞學(xué)檢查被誤認(rèn)為是HSIL（13例）和ASC-H（32例），但其中有45例通過p16INK4a染色結(jié)合細(xì)胞學(xué)檢查被正確識(shí)別，因此p16INK4a免疫染色不僅可作為宮頸HSIL或更嚴(yán)重病變的輔助診斷工具，也有助于判斷LSIL和良性病變，從而減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。

本研究顯示，p16INK4a染色具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：① 陰性預(yù)測(cè)值和特異度高；② 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，p16INK4a染色陽性即可提示早期宮頸上皮內(nèi)病變，相比于p16INK4a/Ki-67雙染經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，且實(shí)驗(yàn)人員更好把控；③ 自動(dòng)化染色標(biāo)準(zhǔn)快速，易于操作。本研究利用全自動(dòng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色儀器，每批可同時(shí)檢測(cè)24例樣本，兩批樣本間隔時(shí)間僅為3.5 h（手工免疫細(xì)胞化學(xué)染色加一抗后需4 ℃過夜）。另外，細(xì)胞學(xué)閱片主要依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)，由于經(jīng)驗(yàn)不足和任務(wù)量大，細(xì)胞學(xué)檢查醫(yī)師常易漏診一些可能發(fā)展為癌前病變甚至宮頸癌的患者，導(dǎo)致假陰性率升高；而p16INK4a染色在顯微鏡下根據(jù)顏色差異即可快速識(shí)別異常細(xì)胞，非專業(yè)技術(shù)人員可以在短期內(nèi)掌握，比較適用于診斷水平和異常結(jié)果檢出率低的經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)大樣本量的宮頸癌篩查。

本研究局限性：① 與國外研究相比，入組的研究對(duì)象樣本量偏少，研究結(jié)果可能存在偶然性因素；② 對(duì)細(xì)胞學(xué)異常和HR-HPV陽性者陰道鏡依從率較高，兩種檢查結(jié)果正常而僅p16INK4a陽性者大部分無隨訪病理結(jié)果，可能會(huì)使p16INK4a的特異度升高。因此，為全面篩查目標(biāo)人群的宮頸情況以及精確評(píng)估p16INK4a的臨床價(jià)值，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)單純p16INK4a陽性者的隨訪管理，以早期發(fā)現(xiàn)潛在宮頸病變；此外，應(yīng)通過媒體廣泛宣傳宮頸健康知識(shí)，提高宮頸癌疫苗的接種率，使目標(biāo)人群自覺接受并重視宮頸癌篩查，以提高陰道鏡依從率，降低宮頸癌發(fā)病率；最后，當(dāng)細(xì)胞學(xué)、HR-HPV檢測(cè)和p16INK4a染色任一結(jié)果陽性時(shí)均建議進(jìn)一步行陰道鏡檢查，從而避免診斷偏倚，更加客觀、準(zhǔn)確地比較其單獨(dú)的敏感度和特異度。

綜上所述，自動(dòng)化p16INK4a免疫細(xì)胞化學(xué)染色可在一定程度上提高宮頸癌篩查的敏感度和特異度，減少漏診和過度診斷，對(duì)臨床診療有較好的輔助分流價(jià)值，能夠降低早期宮頸癌及癌前病變的發(fā)生率，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，有較好的應(yīng)用前景。