斷奶日齡對仔豬天然免疫短期和長期的影響

張振玲（編譯）

(徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程系，江蘇 徐州 221006)

斷奶日齡對于仔豬的免疫系統(tǒng)和皮質(zhì)醇都有影響，不同斷奶日齡產(chǎn)生不同的后果。剛斷奶的仔豬，尤其是那些在20日齡前斷奶的仔豬，更易于感染疾病。16或18日齡斷奶的仔豬比20日齡斷奶的仔豬更容易暴發(fā)大腸桿菌引起的腹瀉。早期斷奶仔豬的中性粒細(xì)胞（N）與淋巴細(xì)胞（L）的比率（N∶L）的升高預(yù)示著急性應(yīng)激、免疫力下降和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而21日齡斷奶仔豬的皮質(zhì)醇升高，淋巴細(xì)胞增殖減少。但也有一些研究發(fā)現(xiàn)斷奶日齡對仔豬的免疫系統(tǒng)（包括適應(yīng)性免疫能力）沒有影響。然而，研究表明，隨著斷奶日齡的增加，由于免疫系統(tǒng)的不斷完善，白細(xì)胞群從14日齡時主要參與天然免疫功能的白細(xì)胞為主轉(zhuǎn)到21日齡和28日齡主要參與適應(yīng)性免疫功能的白細(xì)胞為主，這意味著斷奶日齡對仔豬的內(nèi)分泌和免疫狀態(tài)有短期影響。關(guān)于斷奶日齡對斷奶后仔豬免疫應(yīng)答的影響的科學(xué)資料很少。因此，文章研究的目的是確定和描述斷奶日齡對仔豬應(yīng)激反應(yīng)和免疫狀態(tài)的短期和長期影響。

1 材料和方法

1.1 試驗動物和試驗設(shè)計

試驗仔豬產(chǎn)自于伊利諾伊大學(xué)（University of Illinois）厄巴納研究農(nóng)場的經(jīng)產(chǎn)雜交白毛母豬。試驗仔豬共72頭，分成12窩，每窩6頭（3頭公閹豬、3頭母仔豬），隨機(jī)分入14日齡或28日齡斷奶組。到指定日齡時，每窩3頭公閹豬和3頭母仔豬被隨機(jī)分配到機(jī)械通風(fēng)和環(huán)境良好的豬圈舍內(nèi)飼養(yǎng)至20周齡。同性別內(nèi)試驗仔豬體重相近且對所有仔豬均以達(dá)到或超過推薦的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（NRC，2000）飼喂，每圈都配備了一個杯狀飲水器。

1.2 血樣采集

2個斷奶日齡組分別于斷奶后第1、7、14天以及8、12、16、20周齡時采集血樣。使用含有肝素鈉的真空容器通過前腔靜脈穿刺收集血液樣本并將所采血液樣本立即置于冰上。飼養(yǎng)至8周齡時開始采血，將豬置于仰臥位采血（采血過程≤1 min），12周齡時，將豬保定，站立時取樣（采血過程≤2 min）。

1.3 細(xì)胞的分離和計數(shù)

將肝素處理的全血（10 μL）加入Isoflow（10 mL; Beckman Coulter, Miami, FL），紅細(xì)胞被溶解，用Coulter Z1粒子計數(shù)器（Beckman Coulter）自動測定總白細(xì)胞數(shù)。光學(xué)顯微鏡下對白細(xì)胞進(jìn)行人工分離和計數(shù)以確定各種白細(xì)胞數(shù)量的百分比。全血用RPMI（Roswell Park Memorial Institute）溶解液（Gibco, Carlsbad, CA）稀釋，中性粒細(xì)胞分離液（Hisptopaque-1077）（密度：1.077 g/mL；Sigma）和Hisptopaque -1119（密度：1.119 g/mL；Sigma）進(jìn)行分層，在25?C，700×g下離心30 min。從Hisptopaque-1077層收集淋巴細(xì)胞，在RPMI中洗滌2次再懸浮，并計數(shù)。從Hisptopaque-1119層中除去中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞，在RPMI中沖洗1次，用低溫?zé)o內(nèi)毒素水溶解紅細(xì)胞，用10×PBS恢復(fù)其等滲性。中性粒細(xì)胞在475×g下離心10 min，取上清液，洗滌2次，再懸浮于RPMI中。根據(jù)免疫分析的要求，用RPMI調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度。

1.4 免疫分析

自然殺傷細(xì)胞（NK）的細(xì)胞毒性是使用購買的非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒（羅氏診斷，印第安納波利斯，IN）測量的。簡言之，豬淋巴細(xì)胞被用作效應(yīng)細(xì)胞，K-562慢性人骨髓源性白血病細(xì)胞（美國組織型培養(yǎng)物，Manassas，VA）作為靶細(xì)胞。淋巴細(xì)胞（濃度）調(diào)到 1×107個 /mL，K 562細(xì)胞調(diào)至10 000個/孔。分析樣品設(shè)置3個重復(fù)和4個處理〔效應(yīng)器（淋巴細(xì)胞）：靶細(xì)胞（K-562）分別 為 12.5∶ 1、25∶ 1、50∶ 1和100∶1〕。用微型平板閱讀器（BIO-TEK儀器）在490 nm波長和690 nm的參考波長下讀取結(jié)果。如果最大釋放數(shù)除以自發(fā)釋放數(shù)≤20%，分析結(jié)果認(rèn)為有效。

中性粒細(xì)胞趨化性采用之前描述的測定方法測定。簡單說就是用濃度為3×106個/mL的中性粒細(xì)胞，評估中性粒細(xì)胞遷移至分析培養(yǎng)基（對照組；隨機(jī)遷移）或重組人補(bǔ)體 -5a（hc5a；10-7m ；Sigma）（趨化性測試組；定向遷移）的能力。中性粒細(xì)胞吞噬功能采用以前所描述的方法（略有修改）使用流式細(xì)胞儀測定的。熒光珠與非熱滅活豬血清孵育30 min后，按10∶1（珠粒/中性粒細(xì)胞）比例添加到樣品中。細(xì)胞和珠粒被一起孵育45 min，然后通過流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞吞噬熒光顆粒的百分比。

1.5 血漿分析

血漿總免疫球蛋白（IgG）用ELISA法測定，如Niekamp等在2007年所述。用0.05% Tween-PBS活性劑稀釋豬血漿樣品至1∶3 000。在96孔微孔滴定板上分別滴入120 μL稀釋樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，涂上一層 豬 IgG（Jackson Immunoresearch,West Grove, PA）。兔抗豬IgG （120μL；Sigma，St.Louis，MO）， 在 25 ?C下孵育2 h，然后用0.05% Tween-PBS活性劑洗滌3次。加入酶聯(lián)抗兔IgG（200μL；Jackson Immunoresearch），稀釋倍數(shù)為1∶7 500，平板孵育1 h，倒去液體后再洗3次。加入底 物 溶 液（200 μL；1 mg/mL 對硝 基 苯 磷 酸 酯；Sigma），30 min后， 用 2 M 的 100 μL NaOH 停止反應(yīng)。用微型平板閱讀器（Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）在405 nm波長讀取平板，用標(biāo)準(zhǔn)曲線（0，0.1，0.5，1，5，10，20，40 μg/mL）測定血漿總IgG。血漿皮質(zhì)醇的測定是用購買的里亞試劑包（RIA kit） (Coat-A-Count; Diagnostic Products, Los Angeles, CA）對豬樣品進(jìn)行的，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為7.0%和13.5%，最低可檢測濃度為2 ng/mL。

1.6 統(tǒng)計分析

使用SAS進(jìn)行統(tǒng)計分析（SAS，2012）。檢驗數(shù)據(jù)是否偏離正態(tài)分布，對所有偏離正態(tài)分布的數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對數(shù)變換。采用線性混合效應(yīng)模型，分析跨斷奶日齡的所有變量，包括保育和育肥期重復(fù)的仔豬變量以及日齡對仔豬BW的影響。模型的固定因素為2個斷奶日齡處理（14和28日齡）、斷奶時間（d 0、第1、7、14天和8、12、16、20周齡）和性別（母仔豬和閹割公仔豬）。隨機(jī)因素包括窩和圈。擬合了具有協(xié)方差結(jié)構(gòu)的重復(fù)測度模型以解釋豬內(nèi)重復(fù)測定變量的性質(zhì)。分別用SAS程序的Means和estimate方法比較不同時間點和2個斷奶日齡在每個時間節(jié)點的影響。顯著性設(shè)定為P≤0.05。

2 試驗結(jié)果

2.1 斷奶日齡對免疫狀況的影響

28日齡斷奶仔豬d 0的白細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞計數(shù)均極顯著地高于14日齡斷奶仔豬（P＜0.01；表1），NK細(xì)胞毒性和血漿皮質(zhì)醇濃度亦均極顯著高于14日齡斷奶的仔豬（P＜0.01；表2）。14日齡斷奶仔豬的中性粒細(xì)胞吞噬能力極顯著高于28日齡斷奶的仔豬（P＜0.01；表2）。14日齡斷奶仔豬白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)在斷奶后第7天均顯著高于d 0（P＜0.05；表1），淋巴細(xì)胞計數(shù)和百分比在斷奶后第1、7、14天亦均顯著低于d 0（P＜0.05；表1），中性粒細(xì)胞百分比和N∶L比值在斷奶后第1、7、14天均顯著高于d 0（P＜0.05；表1）。相反，28日齡斷奶仔豬的白細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)在斷奶后第1、7天與d 0相似，但是總白細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞計數(shù)在斷奶后第14天均顯著高于d 0，中性粒細(xì)胞百分比和N∶L比值斷奶后第1天均顯著高于d 0（P＜0.05，表1）。

無論是14還是28日齡斷奶的仔豬在斷奶后第1天的NK細(xì)胞毒性均與d 0相似，但14日齡斷奶仔豬的NK細(xì)胞毒性在斷奶后第7、14天極顯著低于d 0（P＜0.01）。28日齡斷奶仔豬的NK值在斷奶后第7天極顯著低于d 0（P＜0.01；表2）。14日齡斷奶仔豬中性粒細(xì)胞吞噬能力在斷奶后第1天極顯著高于d 0（P＜0.01；表2），但是吞噬功能在斷奶后第14天則極顯著低于d 0（P＜0.01；表2）。相反，28日齡斷奶仔豬中性粒細(xì)胞吞噬功能在斷奶后第1、7天與d 0相似，而在斷奶后第14天則極顯著高于d 0（P＜0.01；表2）。無論是14日齡還是28日齡斷奶的仔豬中性粒細(xì)胞趨化性在斷奶后第1天均顯著大于d 0；而14日齡斷奶的仔豬在第7、14天的趨化性均顯著較小，28日齡斷奶的豬在第14天的趨化性顯著較?。≒＜0.05；表2）。無論是14日齡還是28日齡斷奶的仔豬，其總IgG水平在斷奶后第1、7天與d 0相似；但是在斷奶后第14天，14日齡斷奶仔豬總的IgG水平顯著低于斷奶前，28日齡斷奶的仔豬IgG水平顯著高于斷奶前（P＜0.05；表2）。只有在28日齡斷奶的仔豬皮質(zhì)醇才會受到影響，皮質(zhì)醇在斷奶后第7天顯著低于d 0，在斷奶后第14天顯著高于d 0（P＜0.05；表2）。

表1 斷奶日齡對斷奶前和斷奶后仔豬白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞（N）、淋巴細(xì)胞（L）群和N∶L比值影響

2.2 斷奶日齡對應(yīng)激免疫反應(yīng)的短期影響

28日齡斷奶仔豬在斷奶后第14天總白細(xì)胞數(shù)極顯著（P＜0.01）高于14 日齡斷奶的仔豬（表1），斷奶后第1、7、14天淋巴細(xì)胞數(shù)極顯著（P＜0.01）高于14 日齡斷奶的仔豬。28日齡斷奶仔豬斷奶后第7、14天的淋巴細(xì)胞百分比和中性粒細(xì)胞均極顯著數(shù)（P＜0.01）高于14日齡斷奶的仔豬；14日齡斷奶仔豬在斷奶后第7、14天的N∶L比值極顯著大于28日齡斷奶仔豬（P＜0.01；表1）。28日齡斷奶仔豬在斷奶后第14天血漿IgG水平極顯著高于14日齡斷奶的仔豬（P＜0.01；表2），在斷奶后第1、14天皮質(zhì)醇也極顯著高于14日齡斷奶仔豬（P＜0.01；表 2）。

2.3 斷奶日齡對應(yīng)激免疫反應(yīng)的長期影響

14日齡斷奶仔豬在8周齡時的白細(xì)胞總數(shù)和8、12、20周齡時的淋巴細(xì)胞數(shù)均極顯著（P＜0.01）高于28日齡斷奶的仔豬（表3），8、12、16和20周齡時自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性亦均極顯著大于28日齡斷奶的仔豬（P＜0.01；表4）。而28日齡斷奶仔豬在8周齡時中性粒細(xì)胞吞噬功能（P＜0.01）以及8和12周齡時中性粒細(xì)胞趨化性（P＜0.01）和總IgG（P＜0.05）均極顯著或顯著高于14 日齡斷奶的仔豬（表4）。14日齡斷奶仔豬在12周齡時的皮質(zhì)醇濃度和20周齡時的中性粒細(xì)胞趨化性均較高（表4）。

3 討論

試驗結(jié)果表明，斷奶日齡對參與斷奶應(yīng)激的白細(xì)胞數(shù)量、天然免疫參數(shù)和總IgG濃度均有不同程度的短期和長期影響。正如之前報道的那樣，斷奶確實會引起仔豬應(yīng)激反應(yīng)，不管斷奶日齡是多少，斷奶后第1天外周淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致N∶L的比率升高。而這種白細(xì)胞轉(zhuǎn)移在28日齡斷奶仔豬中是短暫的，因為它們在斷奶后第7天就回復(fù)到了斷奶前的基準(zhǔn)水平。GINK等人也研究了類似的斷奶免疫變化，但是不管仔豬斷奶日齡是多少，斷奶1周后都能恢復(fù)到基線水平（斷奶前）。相反，14日齡斷奶的仔豬則不是如此，白細(xì)胞狀況表明了14日齡斷奶仔豬長期持續(xù)存在斷奶應(yīng)激。尤其是14日齡斷奶豬在斷奶后第7天和第14天，外周血中中性粒細(xì)胞的增多和淋巴細(xì)胞的減少導(dǎo)致N∶L比值顯著升高。中性粒細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)下在外周增殖，導(dǎo)致中性白細(xì)胞減少以及N∶L 比值升高，這是應(yīng)激壓力的表現(xiàn)。應(yīng)激引起的循環(huán)淋巴細(xì)胞減少主要不是由于大規(guī)模的細(xì)胞遭破壞，而是由于糖皮質(zhì)激素引起的淋巴細(xì)胞的“輸送”或重新分布（從血液到其他身體部位）。這些變化被認(rèn)為是為了確保不同類型的細(xì)胞在應(yīng)激反應(yīng)中被傳送到需要它們的地方。

表2 斷奶日齡對斷奶前（d 0)和斷奶后第1、7、14天仔豬天然免疫、免疫球蛋白G以及皮質(zhì)醇的影響

有趣的是，14日齡斷奶仔豬由斷奶應(yīng)激引起的中性粒細(xì)胞減少反應(yīng)與皮質(zhì)醇升高無關(guān)，事實上，在斷奶后第1、7、14天，仔豬的皮質(zhì)醇濃度保持不變，與28日齡斷奶的仔豬相比，14日齡斷奶仔豬的皮質(zhì)醇濃度較低。在斷奶應(yīng)激壓力下皮質(zhì)醇濃度不發(fā)生變化令人驚訝，因為皮質(zhì)醇濃度的增高與斷奶是有關(guān)的，但很快（＜7d）皮質(zhì)醇濃度就回復(fù)到基準(zhǔn)水平。因此，皮質(zhì)醇升高并不是導(dǎo)致14日齡斷奶仔豬在第1、7、14天斷奶后白細(xì)胞數(shù)量變化的主要因素，這是合理的。28日齡斷奶仔豬應(yīng)激表現(xiàn)為白細(xì)胞的變化，但這種變化在斷奶后第7天不明顯；而14日齡斷奶仔豬對斷奶應(yīng)激的反應(yīng)更為嚴(yán)重。然而，盡管14日齡斷奶仔豬的白細(xì)胞分布和N∶L比值表明對斷奶有應(yīng)激反應(yīng)，但這些變化并不影響中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的功能。中性粒細(xì)胞吞噬作用和趨化性是吞噬細(xì)胞的機(jī)制，它們是宿主對病原微生物天然防御所必需的，在斷奶后第1天（吞噬作用）和第7天（趨化性）增強(qiáng)了中性粒細(xì)胞的功能，這意味著14日齡斷奶仔豬仍有活躍的天然免疫應(yīng)答（盡管N∶L比率有很大的提高）。

此外，伴隨著糖皮質(zhì)激素慢慢升高，N∶L 比值慢慢升高，免疫細(xì)胞數(shù)量減少，這些變化往往不是短暫的，也不會在應(yīng)激壓力消退時發(fā)生逆轉(zhuǎn)。盡管14日齡斷奶仔豬的N∶L 比值慢慢升高，但皮質(zhì)醇濃度并沒有隨之慢慢升高，白細(xì)胞譜也發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，因為N∶L比值沒有持續(xù)升高，到8周齡時總白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量增加了。但從長期來看，14日齡斷奶仔豬的中性粒細(xì)胞功能可能受到影響，與28日齡斷奶仔豬相比，14日齡斷奶仔豬在8周齡和12周齡時仔豬中性粒細(xì)胞吞噬功能和趨化性均較低。與28 日齡斷奶仔豬相比，14日齡斷奶豬在8、12、16、20周齡有更活躍的NK活性（天然免疫）和更低的總IgG（適應(yīng)性免疫），提示斷奶日齡可能對豬的免疫反應(yīng)有長期影響（14日齡斷奶豬的天然免疫反應(yīng)較強(qiáng)，28日齡斷奶豬的適應(yīng)性免疫反應(yīng)較強(qiáng)）。14日齡斷奶仔豬在天然免疫方面有一個長期的權(quán)衡或折衷（降低中性粒細(xì)胞功能，以增強(qiáng)NK 細(xì)胞毒性）似乎是合理的。

表3 斷奶日齡對8~20周齡豬白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞(N)、淋巴細(xì)胞(L)和N∶L比值的影響

表4 斷奶日齡對8~20周齡豬天然免疫、免疫球蛋白G 和皮質(zhì)醇的影響

仔豬剛出生時免疫功能非常脆弱，其免疫系統(tǒng)通常要到約1個月大時才能發(fā)育完全。新出生動物在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)發(fā)育前必須主要依靠他們的天然免疫系統(tǒng)。我們以前的工作證實了隨著豬的年齡增長，IgG濃度和有絲分裂引起的B細(xì)胞增殖減少，這些結(jié)果與之前報道的相似。然而，在這項研究中，14日齡斷奶的仔豬在長期內(nèi)沒有更發(fā)達(dá)的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，而是更發(fā)達(dá)的天然免疫反應(yīng)。NK細(xì)胞毒性是與自然殺傷淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的體內(nèi)天然免疫措施，是抵御病菌攻擊的第一道非特異性防線；而IgG是一種抗體，主要參與抗體反應(yīng)，是第2道防線。Niekamp等發(fā)現(xiàn)28日齡斷奶豬的NK活性較高，且隨著年齡的增長，NK活性增加。Annamalai等發(fā)現(xiàn)9日齡哺乳仔豬檢測不到NK活性而26日齡豬的NK活性較高。相反，我們發(fā)現(xiàn)14日齡斷奶仔豬的d 0的NK活性更大，但由于應(yīng)對應(yīng)激壓力，斷奶后卻減弱了，但是仍遠(yuǎn)高于28日齡斷奶仔豬在14日齡至20周齡間的NK活性水平。但是14日齡斷奶仔豬在20周齡時IgG水平較低。這些發(fā)現(xiàn)與之前的研究相矛盾，但這些差異可能部分歸因于本研究與之前工作的不同，尤其是缺乏光周期處理、不同的血液取樣時間表和本研究的持續(xù)時間較長等。但是，這也是有道理的，根本原因就在于14日齡斷奶仔豬的白細(xì)胞譜。不管怎么樣，從長期來看那些14日齡斷奶仔豬的天然免疫反應(yīng)（NK活性）更活躍；而28日齡斷奶豬的體液免疫反應(yīng)（適應(yīng)性免疫）則更強(qiáng)。

4 結(jié)論

總之，無論是14日齡還是28日齡斷奶都存在斷奶應(yīng)激壓力，仔豬在免疫方面有短期也有長期的變化。14日齡斷奶仔豬斷奶后不久的免疫差異（與斷奶前相比）更大且持續(xù)時間更久。從白細(xì)胞數(shù)量、中性粒細(xì)胞功能和NK活性的變化方面看，14日齡斷奶仔豬在斷奶后第7天和第14天，對斷奶有嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)；而晚斷奶（28日齡斷奶）的仔豬在斷奶后第7天所有參數(shù)就恢復(fù)到基準(zhǔn)水平（d 0）。此外，本研究還表明斷奶日齡和斷奶應(yīng)激反應(yīng)對天然免疫和抗體的產(chǎn)生有著不同和長遠(yuǎn)的影響：14日齡斷奶仔豬在20周齡時NK活性更大，而28日齡斷奶仔豬則抗體（IgG）免疫反應(yīng)較強(qiáng)。因此，斷奶日齡可能會對豬的免疫狀態(tài)產(chǎn)生長期的影響。

（原文：Salak-Johnson J L,Webb S R. Short-and Long-Term Effects of Weaning Age on Pig Innate Immune Status[J]. Open Journal of Animal Sciences, 2018, 8(2): 137-150.）