棗屬ITS及psbA-trnH序列PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化與驗證

李學營，索相敏，白瑞霞，彭建營，馬寶玲

（1.河北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，河北 保定 071001；2.河北省農(nóng)林科學院石家莊果樹研究所，河北 石家莊 050061；3.河北省農(nóng)業(yè)特色產(chǎn)業(yè)技術(shù)指導(dǎo)總站，河北 石家莊 050000）

ITS序列是核糖體DNA中位于18S、5.8S和26S之間的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，由ITS1和ITS2組成。ITS高度重復(fù)、長度保守，變異速度較快，可提供豐富的變異位點和信息位點，在植物系統(tǒng)分類和進化研究中被廣泛應(yīng)用。被子植物中ITS（包括5.8S）片段的長度在700 bp左右，加上協(xié)同進化（concerted evolution），使得該片段在基因組不同重復(fù)單元間十分一致，非常適合進行各種分子操作[1]。目前，ITS可能是分子系統(tǒng)學研究中應(yīng)用十分廣泛的基因之一[2]。葉綠體基因為母性遺傳，基因組較小，但包含大量的DNA成分，在分子水平上差異明顯，能為比較進化研究提供基本的信息支持，所涉及的葉綠體基因主要有兩類，編碼基因及非編碼區(qū)序列20種以上[3～17]，已越來越多地應(yīng)用在分子進化和分子系統(tǒng)學研究中。其中，psbA-trnH序列是植物葉綠體基因組中的非編碼區(qū)序列，比較適合屬下種間的劃分，但是單獨基于psbA-trnH序列進行植物系統(tǒng)學分析的報道甚少，將ITS序列與psbA-trnH序列一起進行研究，能夠提高研究的準確性和科學性。

棗屬 （Ziziphus Mill.） 是鼠李科 （Rhamnaceae）中最具經(jīng)濟價值的一個屬，主要分布在亞洲的熱帶和亞熱帶。棗是我國的第一大干果樹種，已成為農(nóng)業(yè)經(jīng)濟增收的重要來源之一。我國棗資源較為豐富，其中原產(chǎn)于我國的種有14個。近年來，在棗屬屬下分類的研究中盡管涉及到形態(tài)學、生物學、同工酶及花粉學等多個方面[18，19]，但大多是針對棗和酸棗進行的，而針對我國其他棗屬植物的ITS及psbA-trnH序列研究尚未見報道。通過不同的反應(yīng)條件，建立棗屬植物的ITS和psbA-trnH序列高效一致的PCR反應(yīng)體系，旨為后續(xù)的棗屬比較分子生物學研究提供更可靠的分子生物學依據(jù)。

表1 供試材料及其來源Table 1 Materials and their origins

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料共13種，包括原產(chǎn)于我國的棗屬12種和1個近緣種斯氏銅錢樹（表1）。7～8月采其嫩葉，用硅膠干燥保存，帶回實驗室，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA的提取 采用改良CTAB法[20]，通過Nano Drop 2000c超微量紫外分光光度計并結(jié)合1%瓊脂糖凝膠電泳測定基因組DNA的濃度和質(zhì)量。TE溶液稀釋至250 ng/μL，-20℃保存，備用。

1.2.2 ITS和psbA-trnH序列PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化設(shè)計 ITS和psbA-trnH序列均采用雙引物 （表2）擴增。

以毛果棗、蜀棗和褐果棗3個試材的總DNA為樣品。參考其他樹種和作物的擴增體系，確定總反應(yīng)體積為50 μL，內(nèi)含dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+2 mmol/L、雙引物各60 ng、TaqDNA聚合酶1.5 U和不同的葉片總DNA模板量（設(shè)50、100、200 ng共3個處理），之后用重蒸水補足。PCR擴增反應(yīng)程序為：①94℃預(yù)變性2 min；②94℃變性1 min，退火溫度分別設(shè)57、55、52和48℃（即4個退火溫度處理），退火1 min，72℃延伸1 min。循環(huán)35次；③保持72℃10 min。不同的退火溫度及不同的DNA模板量組合共設(shè)12個處理（表3）。

表2 ITS和psbA-trnH引物序列的信息Table 2 Sequence of ITS and psbA-trnH primers

表3 對ITS和psbA-trnH PCR擴增時不同退火溫度與DNA模板用量的組合處理Table 3 The annealing temperature and DNA amount in PCR reaction system for ITS and psbA-trnH amplification

以溴酚藍為指示劑，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用0.5 μg/mL EB染色顯影，在紫外透射儀下觀察并拍照。

1.2.3 ITS和psbA-trnH序列PCR反應(yīng)優(yōu)化體系的驗證采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系，對棗屬12個種和1個近緣種共13份材料進行PCR擴增、純化及測序進行驗證。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀檢測，切下目的片斷，然后采用DNA純化回收試劑盒（上海生工）回收目的片段，回收的PCR產(chǎn)物在-20℃保存，用于測序。

測序工作由上海生物工程有限公司負責完成，測序原理是Sanger的雙脫氧終止法，測序儀為ABI377。采用PCR產(chǎn)物直接測序，測序引物與PCR擴增引物一致，2條序列的測序程序均為95℃20 s—50℃20 s—60℃1 min，30個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的質(zhì)量與檢測

所得DNA溶液的A260/A280為1.7～1.9，DNA產(chǎn)量為690～720 ng/μL。說明DNA樣品中基本無蛋白質(zhì)污染，并無降解現(xiàn)象。

2.2DNA模板量對PCR產(chǎn)物的影響

在50 μL反應(yīng)體系中，ITS及 psbA-trnH序列DNA模板量為50～200 ng時，相同退火溫度下，同一序列內(nèi)3個材料間不同DNA模板用量處理的PCR產(chǎn)物亮度一致，無明顯差異。說明在一定范圍內(nèi)，DNA模板的用量對PCR擴增影響不大。因此，從節(jié)約成本的角度考慮，在50 μL反應(yīng)體系中，DNA模板的用量在50 ng時就能擴增出高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物（圖1和2）。

圖1 不同條件下ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence under different conditions

圖2 不同條件下psbA-trnH序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence under different conditions

2.3 退火溫度對PCR擴增產(chǎn)物的影響

從2條序列的PCR擴增產(chǎn)物看，不同退火溫度間同一序列的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶亮度和粗度都存在差異。

當退火溫度為48℃時，2個PCR產(chǎn)物條帶都較亮，但出現(xiàn)了明顯的彌散拖尾現(xiàn)象。說明除了擴增出目的PCR產(chǎn)物外還出現(xiàn)了許多的雜帶，降低了擴增的特異性。這將大大影響后續(xù)試驗，給純化和測序帶來了困難。退火溫度為48℃時并不適合對棗屬ITS和psbA-trnH序列的PCR擴增。

當退火溫度為57℃時，ITS序列的PCR產(chǎn)物條帶較弱；退火溫度為55和52℃時條帶較亮，其中，52℃處理的帶型最好，條帶明亮，粗細適中，沒有雜質(zhì)。說明退火溫度為52～55℃時ITS序列均能擴增出質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物，其中，最佳退火溫度為52℃。

當退火溫度為57和55℃時，psbA-trnH序列的PCR產(chǎn)物條帶都較弱，亮度不夠，說明退火溫度為57和55℃時不能有效地擴增出足夠的PCR產(chǎn)物；退火溫度為52℃時，條帶明顯較亮，且無雜帶，說明退火溫度為52℃最佳。

從試驗結(jié)果看，擴增時psbA-trnH片段要求的退火溫度較ITS序列更為嚴格。

2.4ITS和psbA-trnH序列PCR反應(yīng)優(yōu)化體系的驗證

根據(jù)確立的最適PCR反應(yīng)條件，對棗屬12個種和1個近緣種共13份材料的ITS及psbA-trnH序列進行了擴增。結(jié)果（圖3和4）顯示，PCR擴增后的電泳條帶清晰，無雜帶，擴增效果良好。說明優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定、可靠，可用于棗屬植物系統(tǒng)發(fā)育的研究。

圖3 ITS序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoregram of PCR products for ITS sequence with optimized condition

圖4 psbA-trnH序列的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoregram of PCR products for psbA-trnH sequence with optimized condition

在優(yōu)化PCR反應(yīng)體系下擴增的ITS和psbA-trnH序列完全符合測序的要求，經(jīng)純化后測得的序列完整，正反雙向測序后對比完整，質(zhì)量較高，已經(jīng)提交Genebank數(shù)據(jù)庫。

3 結(jié)論與討論

ITS和psbA-trnH序列測序是基于PCR的分子技術(shù)，而影響PCR反應(yīng)的因素有很多，如dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶等對擴增效率均有一定的影響。對ITS和psbA-trnH序列的PCR研究中，前人對于dNTP、Mg2+、TaqDNA聚合酶用量的優(yōu)化較為成熟。

模板DNA質(zhì)量和濃度是影響PCR擴增效果的關(guān)鍵因素之一，PCR體系中模板DNA濃度范圍較大，但濃度過低或者過高均會對擴增效果產(chǎn)生不良影響[23]。選擇適宜的模板濃度對建立穩(wěn)定的PCR體系很重要，楊培奎等[24]對橄欖ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化時認為，不同物種不同PCR體系中，適宜的模板DNA濃度范圍存在差異，進行PCR體系優(yōu)化時仍有必要將模板DNA作為影響因素。每個物種的DNA長度不同，不同PCR操作中對模板DNA濃度要求上有一定差異。本研究條件下對棗屬ITS和psbA-trnH序列擴增時發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)模板DNA用量對PCR產(chǎn)物影響不大，在利用ITS和psbA-trnH序列進行系統(tǒng)學研究中較少的模板DNA可以擴增出質(zhì)量較高的PCR產(chǎn)物。這對于采樣量困難的植物或標本，基于ITS和psbA-trnH序列進行分析更具有優(yōu)勢。本研究中，對于模板DNA的用量梯度并沒有達到最低用量的極限。

對于ITS和psbA-trnH序列PCR體系優(yōu)化的研究少有報道，但對于其他分子標記的PCR體系進行優(yōu)化的研究中，許多學者對退火溫度進行了優(yōu)化。退火溫度的高低直接影響到PCR產(chǎn)物的質(zhì)量和數(shù)量，不同分子標記、不同引物、不同材料之間存在差異，最佳退火溫度各不相同。本研究中，擴增時psbA-trnH片段要求的退火溫度較ITS序列更為嚴格，但兩段序列的最佳退火溫度相同。

綜上所述，棗屬ITS及psbA-trnH序列優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為：50 μL反應(yīng)體系中，內(nèi)含dNTP 0.2mmol/L，Mg2+2 mmol/L，2條引物各60 ng，TaqDNA聚合酶1.5 U，葉片總DNA模板50 ng。反應(yīng)程序為：①94℃預(yù)變性2 min；②94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min。循環(huán)35次；③最后72℃延伸10 min。