生理苗齡對(duì)番茄嫁接效果的影響

曹玲玲 趙立群 田雅楠

（北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，北京 100029）

番茄作為全世界廣泛栽培的蔬菜種類之一，2014 年全世界總產(chǎn)量1.707 億t，面積500 萬(wàn)hm2（Singh et al.，2017）。嫁接是現(xiàn)代番茄育苗的關(guān)鍵技術(shù)，主要目的是防止土壤病原菌的危害，同時(shí)可以提高番茄植株的水分和養(yǎng)分利用效率，減輕非生物脅迫的不利影響。我國(guó)嫁接技術(shù)研究始于20 世紀(jì)60 年代，目前國(guó)內(nèi)很多單位從事蔬菜嫁接砧木的引進(jìn)、篩選，嫁接方法、方式的研究（王寶駒和武占會(huì)，2018），但是對(duì)于番茄適宜嫁接生理苗齡的研究并不多見。

生理苗齡一般用植株的葉片數(shù)表示，國(guó)內(nèi)番茄嫁接多采用貼接的方法，多數(shù)研究認(rèn)為番茄適宜的嫁接時(shí)期一般為4～6 片真葉（陳銀根 等，2018；王德歡 等，2018）；妙曉莉和孫丙寅（2017）研究認(rèn)為，番茄嫁接的適宜時(shí)期為接穗七葉一心；而國(guó)外的番茄嫁接時(shí)期更是從1 片真葉到5 片真葉不等（Singh et al.，2017）。

過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）是嫁接體發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵酶，能夠氧化吲哚乙酸，調(diào)節(jié)嫁接結(jié)合部生長(zhǎng)素水平，維持激素含量的穩(wěn)定，參與木質(zhì)素合成等（王威 等，2012）。在砧木和接穗維管束橋連接的過(guò)程中，POD 活性的變化與維管組織木質(zhì)化作用相關(guān)，因此POD 活性的峰值應(yīng)該在形成層、木質(zhì)部、韌皮部等組織出現(xiàn)的時(shí)期。植物在遭受機(jī)械損傷后，會(huì)產(chǎn)生一系列次生代謝物質(zhì)，這些次生代謝物質(zhì)主要通過(guò)苯丙烷類代謝途徑生成（吳瓊 等，2016）。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是催化這一途徑的關(guān)鍵酶，又被視為重要的防御酶，當(dāng)植物受到切割和傷害時(shí)，苯丙烷類代謝被激活，PAL 活性迅速上升，參與傷害愈合反應(yīng)和抵抗昆蟲或病菌的入侵。研究POD、PAL 活性的變化對(duì)于確定番茄嫁接后愈合不同階段完成程度有重要參考意義。

番茄在大苗齡嫁接時(shí)育苗時(shí)間長(zhǎng)、占地多，減小嫁接苗齡可以縮短育苗時(shí)間，提高土地產(chǎn)出率，統(tǒng)一嫁接時(shí)期，規(guī)范嫁接技術(shù)，提高嫁接的成活率，簡(jiǎn)化嫁接后管理流程。本試驗(yàn)研究了4 種不同苗齡對(duì)番茄嫁接效果的影響，分別從POD、PAL 的活性變化、嫁接切口愈合組織細(xì)胞觀察、對(duì)定植后秧苗生長(zhǎng)的影響及嫁接成活率等方面加以分析，以期篩選出適合番茄貼接的適宜嫁接苗齡。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

砧木選用京研益農(nóng)（北京）種業(yè)科技有限公司的果砧1 號(hào)，接穗選用北京金土地農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所的金冠58。

播種穴盤采用72 孔標(biāo)準(zhǔn)穴盤，基質(zhì)采用濟(jì)南魯青種苗有限公司的育苗基質(zhì)，使用紅色塑料方口嫁接夾，嫁接刀片為吉列刀片，采用遮光率為70%的黑色遮陽(yáng)網(wǎng)。

試驗(yàn)于2018 年進(jìn)行，田間種植、嫁接及嫁接后管理在北京市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站小湯山展示基地8號(hào)溫室，部分指標(biāo)觀測(cè)和測(cè)定在北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 試驗(yàn)方法

設(shè)4 個(gè)不同生理苗齡處理，處理1：四葉一心（8 月7 日播種）；處理2：三葉一心（8 月12 日播種）；處理3：二葉一心（8 月17 日播種）；處理4：一葉一心（8 月22 日播種）。每個(gè)處理播種4 盤，接穗和砧木同時(shí)播種，二者的生理苗齡基本相同。

4 個(gè)處理均在9 月5 日進(jìn)行嫁接，嫁接前一天將砧木和接穗澆透水，采用貼接的方法，四葉一心和三葉一心的幼苗分別在接穗和砧木的子葉上方1 cm 處切削30°左右的斜面，將砧木根部及接穗頭部的切口充分對(duì)接在一起，用嫁接夾固定；二葉一心和一葉一心由于秧苗較小，子葉上方距離生長(zhǎng)點(diǎn)過(guò)近，切削部位為基質(zhì)上方2 cm 左右處，同樣切削30°左右的斜面，將切口充分對(duì)接在一起，用嫁接夾固定。

將嫁接好的番茄苗集中放置在小拱棚中，棚膜蓋嚴(yán)，并在小拱棚上覆蓋遮光率為70%的黑色遮陽(yáng)網(wǎng)2 層。前3 d 保持密閉，溫度為30 ℃，空氣濕度為90%～100%，3 d 過(guò)后適當(dāng)通風(fēng)、逐步見光，嫁接8 d 后去掉小拱棚，正常管理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 嫁接成活率測(cè)定 每個(gè)處理嫁接200 株以上，植株嫁接后不再萎蔫，并有新葉開始生長(zhǎng)即為嫁接成活。在嫁接后11 d 計(jì)算不同處理的嫁接成活率。

1.3.2 嫁接切口處愈合組織細(xì)胞觀察 主要使用石蠟切片機(jī)、組織脫水機(jī)、恒溫箱等設(shè)備，石蠟、酒精、二甲苯、番紅/固綠染色液、樹膠、明膠、甲醛等藥品；取嫁接結(jié)合部位上下各1 cm 的材料，使用FAA 固定液固定，固定后的材料經(jīng)過(guò)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、烤片、脫蠟、復(fù)水、染色、封片等步驟制作成石蠟切片（張寶華，2013）。

從嫁接后第1 天開始，每天進(jìn)行愈合部組織切片觀測(cè)并拍照，共計(jì)觀測(cè)12 d。

1.3.3 POD 和PAL 活性測(cè)定 POD 活性：取嫁接結(jié)合部位上下各1 cm 組織于預(yù)冷后的研缽中，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9 的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿，3 500 r · min-1離心10 min，上清液即為待測(cè)酶提取液。分別向試管中加入2.4 mL PBS 緩沖液（pH 6.0，0.05 mol · L-1），0.2 mL H2O2（0.1 mol · L-1），0.3 mL 愈創(chuàng)木酚溶液（0.05 mol · L-1），最后加入0.1 mL 上清液組成3 mL 的反應(yīng)體系，37 ℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，反應(yīng)完成后立即取反應(yīng)液測(cè)定420 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。以相同體積的蒸餾水代替上清液加入到反應(yīng)混合液中作為空白對(duì)照。POD 活性用活力單位表示，在37 ℃條件下，每毫克組織樣本每分鐘催化1 μg 底物的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

PAL 活性：取嫁接結(jié)合部位上下各1 cm 組織于預(yù)冷后的研缽中，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）= 1∶9 的比例加入0.1 mol · L-1（pH 為8.8）的硼酸鈉-硼酸緩沖液，再加入適量的石英砂，冰浴研磨后轉(zhuǎn)入離心管中（即得10%組織勻漿）?；靹蚝笤? ℃冰箱中浸提4 h。4 ℃、10 000 r · min-1離心20 min，取上清液即為酶提取液。取酶提取液0.2 mL，加入由硼酸鈉緩沖液配制的0.1 mol · L-1L-苯丙氨酸和2.8 mL 蒸餾水，搖勻，40 ℃水浴反應(yīng)30 min，冰浴終止反應(yīng)，測(cè)定OD290值，以相同體積緩沖液代替酶液進(jìn)行同樣的反應(yīng)為對(duì)照。PAL 活性用活力單位表示，以每小時(shí)在290 nm 處吸光度變化0.01 所需酶量為一個(gè)酶活力單位；∧A 為測(cè)定OD 值-對(duì)照OD 值。

從嫁接后第1 天開始，每天各處理分別隨機(jī)取4 株秧苗，測(cè)定嫁接口處2 種酶活性，共測(cè)定12 次，試驗(yàn)設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.4 番茄定植后形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 各處理同時(shí)定植，分別測(cè)量定植后6、12、18、24、30、36 d 的株高、莖粗等指標(biāo)，采用直尺測(cè)量株高（土表到主枝生長(zhǎng)點(diǎn)的高度），莖粗選擇接口上方1 cm 處使用游標(biāo)卡尺測(cè)量。每個(gè)處理每次測(cè)量5 株，3 次重復(fù)，于上午10：00 進(jìn)行測(cè)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 軟件處理和繪圖，使用IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生理苗齡對(duì)番茄嫁接成活率的影響

從表1 可以看出，四葉一心、三葉一心和二葉一心處理的番茄嫁接成活率較高，均在95%以上，顯著高于一葉一心處理。四葉一心苗齡較大，砧木莖稈出現(xiàn)中空，嫁接后容易感染病菌，阻礙了砧木與接穗接口的愈合速度；一葉一心由于秧苗較小，莖稈對(duì)力的承受能力較差，使用嫁接夾固定時(shí)，出現(xiàn)嫁接夾壓折砧木莖稈的情況，導(dǎo)致一些嫁接苗不成活或植株死亡。

表1 生理苗齡對(duì)番茄嫁接成活率的影響

2.2 不同生理苗齡嫁接傷口愈合過(guò)程的組織解剖結(jié)構(gòu)

圖1 不同生理苗齡嫁接傷口愈合過(guò)程關(guān)鍵天的組織解剖結(jié)構(gòu)

根據(jù)楊歡歡和李景富（2014）的研究，嫁接愈合過(guò)程一般分為4 個(gè)階段。第1 階段：嫁接后3 d生成隔離層；第2 階段：嫁接后6 d 愈傷組織的出現(xiàn)；第3 階段：嫁接后9 d 愈傷組織分化、連接；第4 階段：嫁接后12 d 形成層、輸導(dǎo)組織形成，并開始形成木質(zhì)部與韌皮部。觀察分析本試驗(yàn)中的4 個(gè)處理，從嫁接后2～12 d 的組織解剖結(jié)構(gòu)切片可以看出（圖1），不同生理苗齡嫁接后，4 個(gè)階段出現(xiàn)的時(shí)間并不相同。

四葉一心幼苗在嫁接后3 d 接口附近出現(xiàn)隔離層（圖1-a），7 d 后形成愈傷組織（圖1-b），12 d形成形成層，隔離層逐漸消失（圖1-c）；三葉一心幼苗在嫁接后2 d 出現(xiàn)隔離層（圖1-d），5 d 后形成愈傷組織（圖1-e），10 d 形成形成層，隔離層逐漸消失（圖1-f）；二葉一心幼苗在嫁接后2 d 出現(xiàn)隔離層（圖1-g），5 d 后形成愈傷組織（圖1-h），9 d 后形成形成層，隔離層逐漸消失（圖1-i）；一葉一心幼苗在嫁接后2 d 出現(xiàn)隔離層（圖1-j），5 d后形成愈傷組織（圖1-k），9 d 后形成形成層，隔離層逐漸消失（圖1-l）。由此可以看出，二葉一心和一葉一心處理嫁接后傷口愈合速度最快，三葉一心處理次之，四葉一心處理嫁接后組織形成明顯慢于其他3 個(gè)處理。

2.3 不同生理苗齡嫁接苗POD 活性的變化

從圖2 可以看出，4 個(gè)處理POD 活性的變化基本上都呈現(xiàn)波動(dòng)上升再下降的趨勢(shì)。其中一葉一心處理的POD 活性在嫁接后6 d 最早出現(xiàn)峰值，四葉一心及二葉一心處理則在嫁接后9 d 達(dá)到最高值，三葉一心處理在嫁接后10 d 達(dá)到最高值。與三葉一心處理嫁接后10 d 開始出現(xiàn)形成層、木質(zhì)部等，二葉一心處理在嫁接后9 d 開始出現(xiàn)形成層、木質(zhì)部等的試驗(yàn)結(jié)果基本吻合。

2.4 不同生理苗齡嫁接苗PAL 活性的變化

從圖3 可以看出，一葉一心和二葉一心處理的植株P(guān)AL 活性在嫁接后3 d 出現(xiàn)最高值，四葉一心處理的植株P(guān)AL 活性在嫁接后5 d 出現(xiàn)最高值，且始終處于較高水平，說(shuō)明苗齡較小時(shí)植株對(duì)損傷產(chǎn)生的防御反應(yīng)較快。

2.5 不同生理苗齡嫁接對(duì)番茄定植后生長(zhǎng)的影響

從表2 可以看出，二葉一心處理的株高日均增長(zhǎng)量顯著高于其他處理，莖粗、葉片數(shù)日均增長(zhǎng)量各處理間差異不顯著。二葉一心處理的番茄植株第1 穗果實(shí)的坐果節(jié)位明顯增加；不同苗齡嫁接對(duì)花序數(shù)影響不大，定植時(shí)由于生理苗齡不同，植株的生長(zhǎng)狀態(tài)不同，定植后統(tǒng)一管理使差異逐漸 縮小。

圖2 不同生理苗齡嫁接苗過(guò)氧化物酶活性的變化

圖3 不同生理苗齡嫁接苗苯丙氨酸解氨酶活性的變化

表2 定植后番茄植株的生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論與討論

四葉一心、三葉一心及二葉一心嫁接對(duì)嫁接苗的成活率沒有顯著影響，一葉一心嫁接時(shí)由于植株過(guò)于細(xì)弱，承受不住嫁接夾的重量而導(dǎo)致秧苗折斷，降低了成活率，并不完全是生理苗齡的影響，如果換成質(zhì)量較輕的硅膠夾應(yīng)該可以減少非試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。

從育苗成本來(lái)看，苗齡越大育苗時(shí)間越長(zhǎng)，大苗齡嫁接占用了更多的場(chǎng)地、人工、肥料、農(nóng)藥等生產(chǎn)物資；另一方面，大苗齡嫁接同樣的生產(chǎn)面積需要使用較少孔數(shù)的穴盤，降低了單位面積的秧苗產(chǎn)出率，也增加了育苗成本。在實(shí)際嫁接操作過(guò)程中，四葉一心番茄秧苗較大，切削接穗和砧木時(shí)互相遮擋，不利于操作；一葉一心嫁接時(shí)番茄秧苗較小，莖稈細(xì)弱，固定嫁接夾時(shí)不利于對(duì)齊切口，年齡較大的技術(shù)人員不易看清。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同生理苗齡嫁接對(duì)傷口愈合過(guò)程中的組織解剖結(jié)構(gòu)、POD 和PAL 活性變化均有不同程度的影響。不同生理苗齡嫁接苗POD活性變化趨勢(shì)與嫁接后組織形成的變化趨勢(shì)相吻合，有可能POD 促進(jìn)了形成層、木質(zhì)層等組織的形成；PAL 產(chǎn)生防御機(jī)制，參與傷口愈合和抵御外來(lái)病菌（吳瓊 等，2016），本試驗(yàn)表明，苗齡越小PAL 產(chǎn)生越迅速，說(shuō)明秧苗的活力越強(qiáng)，組織解剖結(jié)構(gòu)切片圖也認(rèn)證了這一點(diǎn)。但是POD、PAL 是否與嫁接后組織形成存在直接相關(guān)性，仍需進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，番茄嫁接的適宜生理苗齡為二葉一心到三葉一心期間，嫁接容易操作、成活率高，可以減少育苗時(shí)間和占地面積，有利于降低嫁接育苗的成本，減少農(nóng)藥肥料的使用量，適宜規(guī)范技術(shù)并推廣應(yīng)用。