燕麥片成品優(yōu)勢菌的篩選及燕麥菌落總數(shù)新檢測閾值的建立

閆驍驤

摘? 要：通過對燕麥成品優(yōu)勢菌的培養(yǎng)、篩選、分離和純化，建立新的檢測閾值并驗證，結果表明，在36℃、GB4789.2-2016規(guī)定的正常檢測接種量的培養(yǎng)條件下，檢測培養(yǎng)40h后，當菌落總數(shù)小于270cfu時，菌落總數(shù)項目檢測結果<10000cfu，食品安全符合國家標準規(guī)定。將燕麥片成品優(yōu)勢菌株經(jīng)過篩選、分離純化和培養(yǎng)后，重新接種于平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，對其生長特性進行研究，以期縮短燕麥菌落總數(shù)檢測時間，為行業(yè)標準技術參數(shù)的更新提供參考。

關鍵詞：燕麥;優(yōu)勢菌;菌落總數(shù);菌落檢測

中圖分類號 TS210.4? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0125-3

燕麥作為一種新興的健康食品，其功能性成分包括但不限于β-葡聚糖、燕麥硒、燕麥酚酸、生物堿、可溶性膳食纖維、類黃酮、植酸、亞油酸、α-亞麻酸等，具有獨特的營養(yǎng)優(yōu)勢。當前，隨著燕麥片生產(chǎn)工藝的逐步成熟和改進，其成品的檢測技術不斷向前發(fā)展，將推動麥類相關檢驗技術的更新，進而影響到燕麥和其他麥類行業(yè)相關檢測標準的建立與完善。為此，本研究開展了燕麥片成品優(yōu)勢菌株的篩選實驗。

1 材料與方法

1.1 供試材料 采用公司實驗室篩選的燕麥優(yōu)勢菌株。主要試劑和儀器如表1和表2所示，其他設備和材料按照GB4789.2-2016中第3章節(jié)的要求購買使用。供應培養(yǎng)基：采用GB4789.28-2013規(guī)定的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。pH自然，121℃高壓滅菌15min備用。

1.2 樣品處理 利用GB4789.1-2016三級采樣方法和樣品處理方法，對燕麥成品進行隨機抽樣。將25g燕麥片溶解于225mL生理鹽水（10倍稀釋度），接種量實驗以此比例為基準進行濃縮;菌落數(shù)量測定實驗，根據(jù)需要同步展開若干個10倍梯度稀釋培養(yǎng)觀察過程，以保證測定結果的準確性。

1.3 燕麥優(yōu)勢菌株的篩選 首先，對燕麥片成品優(yōu)勢菌株進行初步培養(yǎng)和篩選，采用朔州市朔煤古城食品有限公司車間生產(chǎn)的燕麥片成品作為待檢樣品，按照國標GB4789.1-2016和GB19640-2016中規(guī)定的取樣方法進行取樣，其中n=5，c=2，m=104，M=105。采用國標GB4789.2-2016中操作要求的方法對樣品進行處理，進行菌落總數(shù)測定的實驗操作。采用外徑約為95mm、內(nèi)徑約為90mm的玻璃培養(yǎng)平皿，傾倒培養(yǎng)基厚度控制在0.35～0.45mm，接種后在超凈工作臺正置約15min后，在恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h。然后挑取形態(tài)完整、菌落邊緣清晰的優(yōu)勢菌，梯度稀釋平板法進一步分離純化并重復試驗。之后針對再培養(yǎng)的優(yōu)勢菌株進行均勻涂布接種培養(yǎng)，分別觀察燕麥片大小片成品共6批次樣品。優(yōu)勢菌落形態(tài)均呈現(xiàn)表面白色圓形，邊緣整齊光滑，有酵母菌特有香氣，符合酵母菌的菌落形態(tài)常見特征，判定為酵母菌。之后采用GB4789.15-2016霉菌與酵母計數(shù)中提及的選擇性培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱PDA）培養(yǎng)，生物顯微鏡涂片觀察，得到的分離純化后的菌株作為檢測出發(fā)菌株。

1.4 燕麥菌株生長特性指標的測量 結合燕麥產(chǎn)成品國標檢測要求，并充分考慮到酵母菌的菌落形態(tài)特性，邊緣整齊，易于觀察，對每個被均勻稀釋涂布的平皿出現(xiàn)的酵母菌落進行觀察。驗證實驗之前的實驗過程中，設立5組平行實驗，菌落生長特性指標結果，表示為酵母菌落個數(shù)平均結果（cfu/皿）。驗證試驗采用GB4789.2-2016中的規(guī)定方法，進行菌落總數(shù)測定實驗。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度對酵母菌落生長特性的影響 燕麥片成品在平板計數(shù)培養(yǎng)基培養(yǎng)下的優(yōu)勢菌為酵母菌，酵母菌理論最適生長溫度為20～30℃。由于國標要求檢測方法的額定培養(yǎng)溫度為36℃，為了探測36℃培養(yǎng)條件下的燕麥優(yōu)勢酵母菌株的生長情況，實驗設定溫度梯度為3℃，實驗中采用梯度稀釋法。設立同一樣品的菌懸液，相同稀釋度、相同接種量、不同溫度條件下進行培養(yǎng)，觀察所得結果見表3。由表3可知，燕麥優(yōu)勢酵母菌株菌落長勢的最佳培養(yǎng)溫度在30～33℃附近。不同培養(yǎng)溫度對燕麥優(yōu)勢酵母菌株菌落個數(shù)影響力比例為30℃∶33℃∶36℃∶39℃≈2∶1.81∶1.49∶1。

2.3 不同初始接種量對菌落生長特性的影響 實驗中采用梯度稀釋法，設立同一樣品、相同稀釋度的菌懸液，不同倍數(shù)接種量條件下進行培養(yǎng)后觀察。與溫度和時間單因素實驗不同的是，為了更好地對接種量進行控制，本次實驗采用的是單獨批次的燕麥片成品稀釋液，采用的培養(yǎng)基是PCA培養(yǎng)基，測定的是菌落總數(shù)。所得結果見5表。由表5可知，不同初始接種量對燕麥優(yōu)勢酵母菌株菌落總數(shù)影響力比例為n×1∶n×2∶n×3∶n×4≈1∶1.83∶3.83∶8.38。

3 燕麥菌落總數(shù)檢測新閾值的設立與驗證

綜上所述，燕麥優(yōu)勢酵母菌最佳培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間48h后仍然保持較旺生長，燕麥片成品檢測樣接種量與菌落總數(shù)結果接近倍數(shù)關系。以此為據(jù)，設定新的檢測閾，采用平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)40h展開第1次觀測，而后繼續(xù)培養(yǎng)至48h，再觀察1次。記錄的都是菌落總數(shù)。與接種量單因素實驗同步展開驗證實驗，根據(jù)設立閾值，每個接種量分別設計5組平行實驗并觀測整理菌落總數(shù)結果均值。

檢測閾值設立方式如下：結合上述影響力比例數(shù)據(jù)，設定培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為1倍，閾值300cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為2倍，閾值550cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為3倍，閾值1150cfu;培養(yǎng)時間40h，接種量為4倍，閾值2520cfu（這里的1倍接種量指的是25g燕麥片溶于225mL無菌生理鹽水，移液槍吸取1mL，接種在平板上，標記為10倍稀釋度的接種量，接種量若干倍就是通過上述基礎更改料液比進行濃縮，每次吸取1mL進行接種的量，下文同）。

驗證實驗結果為：培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為1倍，40h結果均值270cfu，48h結果均值1500cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為2倍，結果均值490cfu，48h結果均值2800cfu;培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)時間40h，接種量為3倍，結果均值980cfu，48h結果均值5400cfu;培養(yǎng)時間40h，接種量為4倍，結果均值1900cfu，48h結果均值9850cfu，均未超過設立的檢測閾值，也符合GB19640-2016規(guī)定的菌落總數(shù)測定項合格標準，新檢測閾值建立成功。

4 結論與討論

通過本實驗發(fā)現(xiàn)，在36℃，GB4789.2-2016規(guī)定的正常檢測接種量的培養(yǎng)條件下，檢測培養(yǎng)40h，如果菌落總數(shù)小于270cfu，則本次菌落總數(shù)項目檢測結果<10000cfu，食品安全符合國家標準規(guī)定。本實驗中，設立檢測閾值用的是針對燕麥優(yōu)勢酵母菌株的選擇性培養(yǎng)基，而驗證檢測閾值的時候用的是平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，使結果更接近真實工作檢測流程發(fā)生的結果。通過鎖定優(yōu)勢菌以及觀察其生長特性，從而給設定新檢測閾值打下基礎。此外，通過驗證實驗發(fā)現(xiàn)，高濃縮倍數(shù)的接種量并未帶來同比例的菌落總數(shù)增益效果，可能是由于燕麥成品中的β-葡聚糖的抗真菌作用[1-3]。因此，通過新檢測閾值的設立與驗證，可以為燕麥行業(yè)菌落總數(shù)項目檢測提供一定的參考依據(jù)。

參考文獻

[1]張美俊，楊武德，王超，等.燕麥β-葡聚糖含量及其檢測方法研究進展[J].山西農(nóng)業(yè)科學，2019，47（04）：690-694.

[2]姜月紅，李曉林，孫健，等.（1，3）-β-D葡聚糖水平在抗菌藥物治療白色念珠菌病療效中的評價作用[J].中國醫(yī)藥科學，2019，9（05）：22-24，38.

[3]申旺，葉麗燕，楊文麗，等.血漿（1，3）-β-D-葡聚糖在侵襲性真菌感染臨床診治中的應用評價[J].中華醫(yī)院感染學雜志，2018，28（09）：1288-129. （責編：張宏民）