植物病毒病檢測及防治技術(shù)研究進展

張靜雅 何衍彪

摘? 要：植物病毒病與其他植物病害相比，具有危害大、難檢測、難防治的特點。本文結(jié)合植物病毒病的發(fā)生特點綜述了植物病毒病檢測及防治技術(shù)，并對植物病毒病的防治工作進行了展望。

關(guān)鍵詞：植物病毒病;檢測;防治;技術(shù)研究

中圖分類號 S432文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）12-0079-4

Abstract：It's more devastating and difficult to detect the pathogen and manage plant virus disease efficiently than other diseases. The occurring characteristics of plant virus disease are pointed out，and some progresses in detection technology and management technology are reviewed in this paper. At last，the future work of management technology of plant virus disease is prospected.

Key words：Plant virus disease;Detection technology;Management technology

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病毒病是僅次于真菌的第2大類植物病害，世界各地的絕大部分作物都不同程度受其危害。植物病毒在植物細胞中絕對寄生，其復制所需的物質(zhì)、能量、場所完全由寄主細胞提供。由于植物沒有完整的免疫系統(tǒng)，植物病毒病的防治較為困難，一直是植物病害及病毒學研究的難點和熱點問題[1]。

植物病毒必須在寄主細胞內(nèi)營寄生生活，所以一般植物病毒只有在寄主活體內(nèi)才具有活性。僅少數(shù)植物病毒可在病株殘體中保持活性幾天乃至幾年，也有少數(shù)植物病毒可在昆蟲活體內(nèi)存活或增殖。植物病毒?；詮?，某一種病毒只能侵染某一種或某些植物，但也有少數(shù)為害廣泛，如煙草花葉病毒和黃瓜花葉病毒等。植物病毒在寄主細胞中進行核酸（RNA或DNA）和蛋白質(zhì)外殼的復制，組成新的病毒粒體。植物病毒粒體或病毒核酸在植物細胞間轉(zhuǎn)移速度很慢，而在維管束中則可隨植物的營養(yǎng)流動方向而迅速轉(zhuǎn)移，造成全株發(fā)病。

植物病毒的傳播方式主要有繁殖材料傳播、機械汁液傳播、媒介傳播等。病毒病為全株性侵染，染病植株的種子、塊莖、接穗、腋芽等各個部位都帶有病毒。病毒將通過這些繁殖材料進行傳播擴散;植物病毒可以通過機械傷口侵染健康植株，機械摩擦、修剪、移苗都可能導致植物病毒隨汁液傳播;植物病毒病的流行依賴于載體的傳播，這些載體包括昆蟲、土壤中的線蟲、真菌，這其中近80%依賴于特定的媒介昆蟲傳播;這些媒介昆蟲大部分為同翅目的刺吸式口器昆蟲，如蚜蟲、粉虱、飛虱、木虱、葉蟬、介殼蟲等[2]。

1 植物病毒病的檢測技術(shù)

病毒有2大類，以DNA為遺傳物質(zhì)的病毒叫DNA病毒，以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒叫RNA病毒，90%的植物病毒為RNA病毒。早期RNA植物病毒病的檢測一般采用傳統(tǒng)的生物學方法（指示植物檢測法），即通過汁液摩擦接種或嫁接傳染方式將待檢測帶毒植株的汁液接種到一種或幾種指示植物上，觀察其在指示植物上表現(xiàn)出的癥狀來進行檢測的方法。指示植物就是指能對某一種或某幾種病毒及類病毒敏感，被感染后能很快表現(xiàn)出明顯癥狀的植物。傳統(tǒng)的生物學方法鑒定譜廣、操作簡單，但需要培育大量的指示植物，檢測速度慢，且易受外界環(huán)境影響。

隨著電子顯微鏡面世，病毒的真正形態(tài)才得以展現(xiàn)。電子顯微鏡技術(shù)觀測結(jié)果直觀、準確，還可以觀測到病毒引起的寄主細胞的病變和內(nèi)含體特征，是深度研究病毒病機理的重要手段之一[3]。但儀器設(shè)備比較昂貴，制片和操作技術(shù)復雜不易掌握，對操作人員技術(shù)水平要求較高。

由于每一種植物病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特性，人們研究發(fā)明了利用抗原抗體體外特異性免疫反應檢測植物病毒的方法。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）以酶催化的顏色反應來指示抗原抗體的結(jié)合，具有靈敏、快速、特異性強、分析率高、花費少等優(yōu)點，可用于大規(guī)模樣品檢測，是血清學技術(shù)中應用最為廣泛的一種方法，已成為檢測植物病毒的關(guān)鍵技術(shù)[4]。

隨著人們對生物體遺傳物質(zhì)研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)通過核酸可以準確、快速地對植物、動物、微生物進行物種、種群鑒定。基于核酸檢測的分子生物學方法比血清學方法檢測范圍更廣、靈敏度更高、特異性更強，并且適合大批量的樣本檢測，在植物病毒檢測中迅速地得以廣泛應用。主要包括核酸雜交技術(shù)（Nucleic acid hybridization）、反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、熒光定量PCR技術(shù)（real-time PCR）及DNA微陣列技術(shù)（DNA microarray）[3]。核酸雜交技術(shù)根據(jù)互補的核酸單鏈可以重新結(jié)合的原理，將待檢測病毒的一段特定序列用同位素或非放射性地高辛等加以標記制成探針，與目標病毒核酸雜交后便能指示病毒的存在。RT-PCR先把RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進而進行PCR擴增和雜交試驗，多重RT-PCR可以實現(xiàn)多種病毒的同步檢測，是目前廣泛應用的一項分子檢測技術(shù);而熒光定量PCR技術(shù)不僅可以用于定性分析還可以用于定量檢測。

2 植物病毒病的傳統(tǒng)防治技術(shù)

結(jié)合植物病毒病的發(fā)生特點，植物病毒病的傳統(tǒng)防治技術(shù)主要集中在脫毒種苗、媒介昆蟲的防治、接種弱病毒、選育和推廣抗病品種等方面。

植株體內(nèi)的病毒分布存在不均勻性，即頂端分生組織（如根尖和莖尖）含病毒少或不含病毒，莖尖組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)也因此應運而生。莖尖組織培養(yǎng)可以同時實現(xiàn)種苗脫毒和快速繁育兩個目的，目前該技術(shù)已成功應用于甘蔗、馬鈴薯、芋、大蒜、百合、蘭花等根莖植物健康種苗繁育。Hu利用菠蘿莖尖進行分生組織培養(yǎng)，結(jié)果再生苗的菠蘿凋萎病病毒（PMWaVs）脫毒率可達100%，為菠蘿健康種苗的繁育奠定了基礎(chǔ)[5]。

媒介昆蟲是植物病毒病流行擴散的重要途徑，健康種苗的培育、推廣應結(jié)合媒介昆蟲的防治措施才能起到事半功倍的效果。通過媒介昆蟲的防治控制植物病毒病有許多成功的例子。比如通過防治褐飛虱（Nilaparvata lugens）控制水稻矮縮病毒病（rice dwarf virus，RDV），通過防治白背飛虱（Sogatella furcifera）控制南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV），通過防治煙粉虱（Bemisia tabaci）控制番茄黃化曲葉病毒?。═omato yellow leaf curl virus，TYLCV）[2，6]。何衍彪等（2013），通過誘殺田間螞蟻防治菠蘿潔粉蚧（Dysmicoccus brevipes），進而達到控制凋萎病（Mealybug wilt of pineapple，MWP）的目的[7]。

早在上世紀20年代末，人們就發(fā)現(xiàn)接種了弱毒株病毒之后的植物確實能對同種病毒的強毒株產(chǎn)生抗性，這被稱為“交叉保護”現(xiàn)象。但是，對于大量種植的作物來說，對所有的植株逐一進行弱毒株接種需要耗費大量的人力、物力，防治成本過高。而且，并不是每一種植物病毒都存在弱毒性的株系，因此具有一定的局限性。

篩選和培育抗性品種是防治作物病蟲害的有效方法，但由于植物病毒變異速度很快，非常容易突變出能克服植物抗病毒基因的新毒株，從而喪失抗性，因此通過常規(guī)選育和推廣抗病品種防治植物病毒病十分困難。

3 植物病毒病防治新技術(shù)

3.1 新型植物抗病毒藥劑 病毒侵入植物體內(nèi)之后，利用宿主細胞里的資源，大量復制自己的基因組并制造新的蛋白質(zhì)外殼，再組裝起來，就形成了許多新一代的病毒顆粒，然后去感染宿主更多的細胞和器官。由于普通化學藥物通常無法抑制病毒在宿主體內(nèi)的復制、增殖，因此很難研制出有效的殺病毒的化學藥劑。20世紀50年代前后科研人員篩選到一些能防治受感染植物的病毒復制的化學物質(zhì)，但后來發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)一般只能暫時抑制病毒增殖，推遲病害癥狀顯現(xiàn)，停止用藥后病毒又馬上開始增殖，而且容易使寄主植物產(chǎn)生藥害[1]。

隨著誘導抗性研究的進展，20世紀90年代以來抗植物病毒劑的研究開發(fā)又成為一個新熱點。首先是篩選出一些既對病毒表現(xiàn)抑制活性又對寄主與環(huán)境友好的天然活性物質(zhì)，然后通過天然活性物質(zhì)的作用機理指導高效、安全的抗植物病毒劑的人工合成。

至1988年，至少發(fā)現(xiàn)180種被子植物具有強烈抑制植物病毒侵染的作用，它們主要分布于商陸科、藜科、莧科、紫茉莉科等植物中[1]。隨著現(xiàn)代化學分析技術(shù)的不斷進步、完善，天然抗植物病毒抑制劑的活性成分不斷被發(fā)現(xiàn)。例如中草藥丁香所富含的丁香酚不僅對真菌、細菌有良好的抑制作用，還對西葫蘆病毒病、番茄黃化曲葉病等有良好的治療效果[8，9]。目前，植物中報道較多的抗植物病毒活性物質(zhì)是多肽、酶等堿性蛋白或蛋白類似物;而微生物及其次級代謝產(chǎn)物的抗植物病毒活性物質(zhì)多為糖類[1，10]。

李丹等（2009）對采自云南的17種大型食用真菌子實體的浸提液及其多糖組分，用半葉法在心葉煙上分別從預防（施用提取物24h后接種病毒）、鈍化（提取物與病毒混合后接種）、治療（接種病毒24h后施用提取物）3個方面進行抗煙草花葉病毒TMV活性檢測。發(fā)現(xiàn)實驗真菌的治療效果總體不如鈍化效果明顯，多糖組分可能是抑制TMV的主要活性成分[11]。

活性成分研究的目的是形成產(chǎn)品，并服務于生產(chǎn)。2001年，貴州大學綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室、精細化工研究開發(fā)中心聯(lián)合開發(fā)了含氟氨基膦酸酯類抗植物病毒劑，該產(chǎn)品對煙草、黃瓜、番茄等作物病毒病具有良好的防治效果[12]。2014年，中國農(nóng)科院植保所基于細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）的主效蛋白激發(fā)子PeaT1和Hrip1，通過與氨基寡糖素科學配伍而研制出我國第1個植物免疫蛋白制劑“阿泰靈”。該產(chǎn)品的蛋白激發(fā)子PeaT1和Hrip1能提高植物體內(nèi)相關(guān)防衛(wèi)基因的表達，對番茄黃化曲葉病、南方水稻黑條矮縮病等有良好的防治效果[13]。目前通過化學合成具有抗植物病毒活性的化合物，從結(jié)構(gòu)上來看，主要包括即雜環(huán)類、核苷酸、生物堿、取代苯、醛類及其縮合物、有機磷、氨基酸衍生物等[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，我國目前登記防治農(nóng)作物病毒病的藥劑共有169件，主要包含菌毒清、寧南霉素、鹽酸嗎啉胍、菇類蛋白多糖、氨基寡糖素等14個單劑和復配劑。

3.2 基因工程技術(shù) 病毒侵染植物后會產(chǎn)生大量病毒來源的小RNA（virus-derived small interfering RNAs，vsiRNA），可以通過介導對這些病毒RNA的降解或抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄來抵抗病毒侵染。植物抗病毒過程是RNA沉默介導的病毒RNA與所轉(zhuǎn)病毒基因的mRNA均被降解的過程[14]。隨著近年來RNA干擾機制研究的不斷深入，利用RNA干擾的高效性和特異性來控制植物的病毒病已開始得到科學家們的重視，并取得了一定的成效[15]。

1986年，華盛頓大學的Powell通過基因工程技術(shù)，首次將煙草花葉病毒外殼蛋白（CP）基因轉(zhuǎn)入煙草，培育出能穩(wěn)定遺傳的抗TMV的植株[16]。劉玉樂等（1993）在世界上首次應用黃瓜花葉病毒（CMV）致弱satRNA防治黃瓜花葉病毒獲得成功，將合成的R1分離物satRNA的cDNA導入煙草中，發(fā)現(xiàn)該煙草可有效地阻止CMV的侵染[17]。

朱俊華等（2004）把煙草馬鈴薯Y病毒（PVY）外殼蛋白基因片段的反向重復序列導入煙草，獲得了對PVY免疫的植株[18]。牛顏冰等（2005）將番茄花葉病毒移動蛋白基因（ToMV-MP）的反向重復結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化煙草，在所得47株轉(zhuǎn)基因煙草中有23株對ToMV具有免疫作用;將煙草花葉病毒部分復制酶基因（CMV-ΔRep）的反向重復結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化煙草，在所得40株轉(zhuǎn)基因煙草中有25株對CMV具有免疫作用[19]。Huang等（2009）在煙草上用DNA1作為載體沉默了AtTOM的同源基因NbTOM1和NbTOM3，發(fā)現(xiàn)對AtTOM同源基因的沉默能夠顯著抑制煙草花葉病毒的增殖[20]。

目前世界上已被獲準商品化種植的抗病毒轉(zhuǎn)基因作物有木瓜、馬鈴薯（2001年因銷路不佳不再銷售）、葫蘆瓜（轉(zhuǎn)基因所占比例13%）等。我國也培育出了多種抗病毒轉(zhuǎn)基因作物，已獲得安全證書的轉(zhuǎn)基因作物有7種，但目前僅有辣椒、木瓜獲得農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書，其中轉(zhuǎn)基因木瓜已在廣東省商品化種植。

4 展望

盡管國內(nèi)外科研人員成功研制了一系列新型植物抗病毒藥劑，但其規(guī)模、數(shù)量遠遠落后于殺蟲劑、殺菌劑，且大多數(shù)表現(xiàn)為保護作用，對植物病毒病的治療效果還不是十分理想。但以環(huán)境友好的天然物活性物質(zhì)為先導，開發(fā)“新型、高效、安全”的農(nóng)藥品種依然是今后植物抗病毒藥劑的發(fā)展方向。基因工程技術(shù)為植物病毒病的防治提供了新的手段，但轉(zhuǎn)基因抗病品種仍然面臨變異病毒、外來病毒的挑戰(zhàn)，加上人們對轉(zhuǎn)基因食品的安全性認識還不統(tǒng)一，其在植物病毒病，尤其是糧食、水果、蔬菜病毒病的防治上的應用還有很長的路要走。

植物病蟲害的防治須遵循“預防為主，綜合防治”的植保方針。人們對植物病毒病的認識相對較少，今后除了在不斷探索新的基因工程技術(shù)、研制新型植物抗病毒藥劑之余，還需要加強植物檢疫工作，繼續(xù)開展脫毒種苗、媒介昆蟲的防治、接種弱病毒以及選育和推廣抗病品種等傳統(tǒng)防治技術(shù)方面的研究。

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（責編：楊 林）