土傳病原真菌及其生防細(xì)菌的分離鑒定

蘇 靜，李雙明

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院病理科，甘肅 蘭州 730050)

土壤既是土傳病原真菌的源，同時也是生防微生物的源?？茖W(xué)研究工作者經(jīng)常從發(fā)病植株的根際篩選生防微生物。德國微生物學(xué)家Lorenz Hiltner于1904年首次提出根際的概念為根系周圍、受根系生長影響的土體[1,5]。根際作為根系、土壤界面的一個微環(huán)境，是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合、相互影響的場所[5-6]。植物根際土壤中存在豐富多樣的細(xì)菌，放線菌和真菌菌株，包括具有豐富的生防功能的菌株。生防微生物通過與病原微生物的競爭、拮抗、抗生和重寄生等達(dá)到抑制或消滅病原微生物，通過誘導(dǎo)寄主植物抗病性、分泌植物生長激素和溶磷解鉀固氮等促進(jìn)植物生長[7]。有關(guān)植物病害生防細(xì)菌資源的研究和應(yīng)用已成為病害生防領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在“兩減”的大背景下具有廣闊的前景。

草坪球場和農(nóng)田系統(tǒng)類似，都容易產(chǎn)生連作障礙，持續(xù)受到土傳病害的侵染，從而降低其生產(chǎn)力。將分離自甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地的土傳真菌，通過離體葉片和皿內(nèi)幼苗接種土傳真菌分離物測定其致病性，利用形態(tài)學(xué)鑒定方法確定其分類地位；在此基礎(chǔ)上，通過平板稀釋法分離根際微生物，利用皿內(nèi)拮抗試驗(yàn)篩選拮抗細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子鑒定方法確定拮抗菌的分類地位。旨在明確甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地的土傳病原真菌種類，并篩選相應(yīng)的生防細(xì)菌，為科學(xué)管理實(shí)訓(xùn)基地提供理論基礎(chǔ)，并為生防細(xì)菌資源進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 區(qū)域概況

試驗(yàn)地處于甘肅省蘭州市安寧區(qū)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地。地理坐標(biāo)為N 36°9′，E 103°7′，海拔1 531 m，氣壓84 KPa。溫帶大陸性氣候，年均氣溫10.3 ℃。年均日照時數(shù)2 446 h，無霜期180 d，年平均降水量327 mm。實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)草坪草主要為高羊茅(Festucaelata)和黑麥草(Loliumperenne)混播，還有紫羊茅(Festucarubra)和翦股穎(Agrostismatsumurae)等。

1.2 土壤采樣

試驗(yàn)以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地土壤為研究對象，隨機(jī)設(shè)置5個3 m×3 m的樣地，在樣地內(nèi)采用5點(diǎn)取樣法，用直徑為5 cm的土鉆鉆取0～20 cm的土壤，將土壤均勻混合后裝入無菌聚乙烯自封袋，轉(zhuǎn)至冰盒保存并帶回試驗(yàn)室于當(dāng)天分離培養(yǎng)土壤微生物。

1.3 土壤微生物的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

稱取10 g含根土樣，置于盛有90 mL無菌水的(加玻璃珠)三角瓶中，在搖床上以150 r/min振蕩15 min后制成10-2懸液后備用。

采用平板涂抹法涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL)，每皿200 μL懸液進(jìn)行真菌的分離，3個重復(fù)，接種后置25±1℃恒溫箱培養(yǎng)5 d，對分離菌株進(jìn)行統(tǒng)計、編號、純化保存。將純化菌株接種于PDA平板上，每隔24 h觀察菌落形態(tài)和顏色；并制作玻片置生物顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及分生孢子形態(tài)等,并進(jìn)行鑒定[8-11]。

采用平板涂抹法涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL)，每皿200 μL懸液進(jìn)行細(xì)菌的分離，3個重復(fù)，轉(zhuǎn)置28±1℃恒溫箱培養(yǎng)3 d后,對分離菌株進(jìn)行統(tǒng)計、編號、純化保存。以備土傳病原真菌的拮抗試驗(yàn)和細(xì)菌分離物的鑒定，將純化菌株劃線接種于NA平板上，24 h后觀察記錄菌落形態(tài)、大小、光澤、質(zhì)地及培養(yǎng)基的顏色等特征[12]。

1.4 真菌分離物的致病性測定

(1)離體植物組織接種法[13]：采集健康的黑麥草的莖基部(長3 cm)，轉(zhuǎn)至培養(yǎng)皿(9 cm)造傷口接種土壤真菌分離物的分生孢子懸浮液(空白對照接種無菌水)，于25±1℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗保濕培養(yǎng)48 h后正常12 h光暗交替培養(yǎng)，3個重復(fù)，3 d后觀察記錄離體葉片侵染癥狀。(2)皿內(nèi)發(fā)芽接種法[14]：將分離物在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后打成直徑5 mm的菌餅轉(zhuǎn)置皿內(nèi)發(fā)芽后的健康無病的黑麥草(每皿10株)幼苗，以接種5 mm PDA培養(yǎng)基餅為對照，3次重復(fù)，連續(xù)觀察記錄皿內(nèi)苗的發(fā)病情況。

新聞發(fā)布會由滕州市委宣傳部副部長魏峰主持。在新聞發(fā)布會上，滕州市農(nóng)業(yè)系統(tǒng)黨委書記、農(nóng)業(yè)局局長李廣耀介紹了滕州馬鈴薯產(chǎn)業(yè)融合發(fā)展和節(jié)會有關(guān)情況。

1.5 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法將病原真菌置于PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)5 d，后打成直徑為5 mm的菌餅，接種在PDA培養(yǎng)基中央，土壤根際細(xì)菌分離物純培養(yǎng)物經(jīng)24 h活化培養(yǎng)后點(diǎn)接在距菌餅2.5 cm處，每平板4點(diǎn)，以點(diǎn)接無菌水為對照，25℃培養(yǎng)，3次重復(fù)，待對照病原真菌長滿培養(yǎng)皿后，測量處理菌落直徑(cm)，以抑菌率表示細(xì)菌的抑菌能力[15]。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

1.6 拮抗菌株的16S rDNA基因鑒定

細(xì)菌DNA提取：細(xì)菌活化后在NB培養(yǎng)液中28℃振蕩過夜培養(yǎng)，使用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Bacteria DNA Kit細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型，目錄號，DP302)，進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取，方法參照試劑盒說明書。

細(xì)菌基因擴(kuò)增[16]：使用27 F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、1492 R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)為引物(武漢金開瑞生物工程有限公司合成)，擴(kuò)增菌株的16S rDNA。PCR體系建立(50 μL)：PremixTaq25 μL，1492R 1 μL，27F 1 μL，DNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，33個循環(huán)；72℃終延伸5 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行檢測。將測得的DNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫取得序列號。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將測序后獲得的細(xì)菌的DNA序列分別提交到NCBI網(wǎng)站中的Blast進(jìn)行序列比對，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中下載的序列信息，利用 MEGA(6.0)軟件進(jìn)行多重序列比較，并采用Neighbor-Joining法構(gòu)建16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 土傳真菌多樣性及其致病性

從草坪實(shí)訓(xùn)基地的土壤中分離得到18株真菌分離物，按照菌落形態(tài)特征將其歸類為5種真菌分離物并編號為GSAF1、2、3、4和5(表1，圖1)。根據(jù)真菌的形態(tài)學(xué)特征(圖2)，初步將GSAF1，4和5分別鑒定為鏈格孢屬(Alternariasp.)、立枯絲核菌(Rhizotoniasolani)和鐮孢菌屬(Fusariumsp.)，GSAF2和3暫時未明，有待分子鑒定方法進(jìn)行分析。通過離體葉片和皿內(nèi)發(fā)芽致病性測定試驗(yàn)，接種孢子懸浮液和菌餅7 d后土傳真菌GSAF1，4和5對黑麥草的離體莖基部和皿內(nèi)幼苗表現(xiàn)出了侵染癥狀，表明這3種土傳真菌在室內(nèi)具有一定的致病性(表1)。

2.2 根際土壤細(xì)菌分離及拮抗菌篩選

從土壤中分離得到12株細(xì)菌分離物，編號為ZSR20-ZSR32，經(jīng)平板對峙拮抗篩選結(jié)果表明， 3株細(xì)菌對鏈格孢屬、立枯絲核菌和鐮孢菌屬有拮抗效果，其中菌株ZSR30的抑菌能力略高于菌株ZSR32，對3種土傳病原真菌的抑菌率均高于30%，對立枯絲核菌的抑菌率達(dá)36.2%；ZSR32菌株對3種病原真菌也有一定的抑菌作用；ZSR26對3種土傳病原真菌的拮抗抑菌作用較低，抑菌率均小于20%(表2)。其余菌株未見拮抗能力。

表1 草坪實(shí)訓(xùn)基地土壤真菌種類及其室內(nèi)致病性測定

注：+，致?。?，不致病

圖1 5種土傳真菌在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的單菌落形態(tài)特征Fig.1 The morphology of single colony of 5 soil-borne fungi cultured on potato dextrose agar

圖2 土傳真菌細(xì)胞形態(tài)特征Fig.2 The morphology of soil-borne fungi cell注：A(GSAF1) 鏈格孢屬；B(GSAF4) 立枯絲核菌；C1-C3(GSAF5) 依次為鐮刀菌屬的大型分生孢子，小型分生孢子和厚垣孢子

具有拮抗能力的3株細(xì)菌分離物的形態(tài)特征為，ZSR26：G+，菌體桿狀，單菌落近圓形，呈柳絮狀，稍有凸起，接近白色，稍有光澤，邊緣不整齊，有褶皺，半透明，略有粘度，直徑3～8 mm(圖3A、A1)；ZSR30：G+，菌體桿狀，單菌落圓形或近圓形，中間凹陷，接近白色，邊緣不整齊，有褶皺，稍有光澤，不透明，有粘度，直徑8～10 mm(圖3B、B1)；ZSR32：G+，菌體桿狀，單菌落近圓形或圓形，且稍凸起，接近白色，邊緣不整齊，有褶皺，半透明，略有粘度，直徑4～8 mm(圖3C、C1)。

表2 3種細(xì)菌分離物對3種土傳病原真菌的抑菌效果

圖3 3種根際細(xì)菌分離物在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的形態(tài)特征及革蘭氏染色的菌體形態(tài)Fig.3 The morphology of single colony of three soil-borne bateria cultured on nutrient agar and their Gram stain

2.3 拮抗細(xì)菌的16S rDNA鑒定

成功提取拮抗細(xì)菌基因組DNA并擴(kuò)增出16S rDNA序列(圖4)。經(jīng)16S rDNA序列相似性分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育分析。測定的基因序列分別為，ZSR26(1384 bp)，ZSR30(1 412 bp)和ZSR32(1 417 bp)(表3)。

圖4 ZSR26，ZSR30和ZSR32菌株P(guān)CR產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoregram of PCR products of ZSR26,ZSR30 and ZSR32

其序列與GenBank中已報道的序列比較，結(jié)果表明：ZSR26的99%相似于內(nèi)生芽孢桿菌(MH168995.1，GU339236.1和KX783541.1)；ZSR30和ZSR32的99%相似于芽孢桿菌屬(MF139324.1，JF496436.1，JF496449.1)。鑒于未結(jié)合其他鑒定手段，初步將ZSR26，ZSR30和ZSR32菌株均鑒定為芽孢桿菌屬Bacillussp.。

表3 細(xì)菌分離物ZSR32，ZSR30和ZSR26的16S rDNA序列分析

圖5 3株拮抗細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of 3 antibiotic bacteria

3 討論

土壤含有豐富的有機(jī)物，為其中的真菌、細(xì)菌、線蟲以及原生動物等提供了基礎(chǔ)營養(yǎng)，同時也構(gòu)成了動態(tài)平衡的土壤中的食物網(wǎng)。土壤中某一類微生物的富集，往往容易擾亂系統(tǒng)，打破平衡，從而衍生一系列問題。薛泉宏等[17]報道，在同一田塊連續(xù)多年種植同一作物會導(dǎo)致該作物產(chǎn)量和品質(zhì)下降,病蟲害加重,連茬作物生產(chǎn)力下降，土壤生物退化。甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地始建于2007年，多年重復(fù)利用黑麥草和高羊茅建植的草坪，土壤中存在大量的鏈格孢屬，立枯絲核菌和鐮孢屬的真菌，其菌在室內(nèi)對黑麥草離體莖基部和皿內(nèi)幼苗具有致病性，與其他研究中的3種菌的致病性的報道一致[18-19]。研究中立枯絲核菌和鐮孢屬可以引起多種作物和牧草的葉斑、莖基腐、根腐等病害，是土傳病害的重要病原，同時也是土壤退化的重要指示病原真菌[3]。鏈格孢屬存在于多種生態(tài)環(huán)境下，可以引起如馬鈴薯早疫病、番茄早疫病等病害，可存活于土壤中。鏈格孢屬，立枯絲核菌和鐮孢屬存在于草坪實(shí)訓(xùn)基地土壤中，隨著種植年限的延長，它們將成為草坪可持續(xù)利用的重要限制因子，應(yīng)因地制宜、生態(tài)環(huán)保地進(jìn)行綜合管理，提高草坪利用年限。

芽孢桿菌屬(Bacillussp.)對各種環(huán)境條件具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，廣泛地存在于土壤，水和空氣中，與自然界中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化、土壤肥力、環(huán)境衛(wèi)生等均密切相關(guān)[20]。有的能水解淀粉，分解蛋白質(zhì)、果膠、藻酸鹽等，工業(yè)上用于提取淀粉酶、蛋白酶、果膠酶等[20]。有的能分泌IAA、溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷，還可以解鉀，同時對多種作物的真菌性病害具有拮抗抑制作用，是重要的生防菌，被廣泛的應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.faciens)[21-22]。試驗(yàn)從實(shí)訓(xùn)基地的土壤中分離得到了3株芽孢桿菌屬的細(xì)菌，且對土傳病原真菌具有較好的拮抗作用，為實(shí)訓(xùn)基地內(nèi)因地制宜和生態(tài)環(huán)保的控制土傳病原真菌提供了菌種資源，為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用平板稀釋涂抹法從甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪實(shí)訓(xùn)基地的土壤中共分離得到18株真菌分離物和12株細(xì)菌分離物。室內(nèi)致病性測定表明真菌分離物GSAF1，4和5具有致病性，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定初步明確它們?yōu)殒湼矜邔?、立枯絲核菌和鐮孢屬。采用皿內(nèi)拮抗法篩選了12株細(xì)菌分離物對3種土傳病原真菌具有拮抗作用的3株細(xì)菌，抑菌率最高為36.2%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和16S rDNA分子鑒定方法，初步將ZSR26，30和32均鑒定為芽孢桿菌屬。