從Wnt/β-catenin信號(hào)通路研究地黃飲子湯劑對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的防治作用*

席永斌，顏春魯，孫仕華，蔡成成，王經(jīng)韜

(1. 蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種主要累及中老年人群的全身骨代謝障礙的疾病，主要特征是骨量減少、結(jié)構(gòu)退化、骨脆性增加，致殘率和死亡風(fēng)險(xiǎn)極高[1-2]，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本課題組前期研究[3]發(fā)現(xiàn)，地黃飲子水煎劑能顯著提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度OPG含量，顯著降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠RANK和RANKL含量，從而通過(guò)促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收來(lái)調(diào)節(jié)骨代謝。為了進(jìn)一步明確地黃飲子的治療機(jī)制，本研究通過(guò)觀察去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的股骨病理形態(tài)改變及股骨組織中Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)水平的變化，從而初步揭示補(bǔ)腎中藥地黃飲子防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康雌性SPF級(jí)SD大鼠60只，平均體質(zhì)量(180±20)g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(甘)2011-0001。

1.2 藥品、試劑與儀器

地黃飲子處方組成：熟干地黃12 g，巴戟天15 g，山萸肉15 g，石斛15 g，肉蓯蓉15 g，附子15 g，五味子15 g，肉桂15 g，白茯苓15 g，麥冬15 g，石菖蒲15 g，遠(yuǎn)志15 g。藥材均購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。劑量換算方法參考《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》，地黃飲子人常用劑量是177 g/d，換算成標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量大鼠的劑量為 177×0.018=3.186 g/只。按照大鼠的標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量為200 g，則大鼠的劑量為3.186 g×5≈16 g/kg。依此劑量為大鼠的中劑量，則地黃飲子高、中、低劑量分別為32，16，8 g/kg。常規(guī)水煎，制成含生藥 1.593 g/mL的藥液。水合氯醛，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20150105；戊酸雌二醇片，1 mg/片，購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)156A；青霉素，160萬(wàn)U/瓶，購(gòu)自華北制藥股份有限公司，批號(hào)F6042103；GAPDH抗體，購(gòu)自Immuno Way公司，批號(hào)B4501； Wnt1和LRP5抗體均購(gòu)自Abcam，批號(hào)依次為GR288344-1，GR274173-1；Wnt和β-catenin抗體購(gòu)自GeneTex，批號(hào)依次為42536，47854。BioMATE 3S型蛋白、核酸濃度測(cè)定儀，Thermo公司產(chǎn)品；ChemiDocTMXRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品；BX53型顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；ZY12306型微量加樣器，ScienTiFic產(chǎn)品；OSE-Y10型電動(dòng)組織研磨器，上海Tiangen 公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組、模型的建立與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，戊酸雌二醇組，地黃飲子湯劑高、中、低劑量組，每組10只。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 g/L 的水合氯醛(3 μg/g)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥位姿勢(shì)固定于自制的鼠架上，從腰背部脊柱兩側(cè)作縱行切口切開(kāi)皮膚和肌肉，摘除兩側(cè)卵巢組織后逐層縫合，關(guān)閉創(chuàng)口[4]。假手術(shù)組大鼠只切除卵巢附近脂肪組織。術(shù)后使用青霉素防感染，使用電暖器保溫。造模成功后12周給予藥物治療。地黃飲子湯劑高、中、低劑量組依次給予地黃飲子湯劑32，16，8 g/kg體質(zhì)量，戊酸雌二醇組給予戊酸雌二醇片0.09 μg/g體質(zhì)量，假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠給予等體積蒸餾水，均灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù)4周。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

末次給藥24 h后，用電子天平稱(chēng)量各組大鼠體質(zhì)量，麻醉后股動(dòng)脈采血，處死各組動(dòng)物，摘取子宮并稱(chēng)量質(zhì)量，摘取左側(cè)股骨做HE染色，摘取右側(cè)股骨做Wnt、Wnt1、β-catenin和LRP5蛋白表達(dá)的測(cè)定。

1.4.1 子宮指數(shù)

子宮指數(shù)(mg/g)=子宮質(zhì)量(mg)/大鼠體質(zhì)量(g)

1.4.2 股骨組織病理形態(tài)改變

將以40 g/L 多聚甲醛固定液浸泡的左側(cè)股骨送往蘭州大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室，脫鈣處理 1周后制作石蠟切片，切片厚度5 μm， HE染色后請(qǐng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室的老師進(jìn)行閱片。HE染色的具體方法參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行，光鏡下觀察各組大鼠骨組織的病理形態(tài)變化。

1.4.3 股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)

以RIPA裂解液提取右側(cè)股骨總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，生理鹽水調(diào)整各檢測(cè)樣品的蛋白質(zhì)量濃度為5 g/ L，加入4×上樣緩沖液，沸水浴5 min后取10 μL 樣品進(jìn)行 SDS-PAGE 凝膠電泳并進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗Wnt、Wnt1、β-catenin和LRP5的孵育、TBST洗滌、二抗孵育，最后進(jìn)行顯色、曝光、顯影、定影，并觀察其蛋白表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠子宮指數(shù)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠子宮指數(shù)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，地黃飲子中、高劑量組和戊酸雌二醇組大鼠子宮指數(shù)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表 1。

組 別子宮指數(shù)/ (mg·g-1)假手術(shù)組1.87±0.15模型對(duì)照組0.67±0.11?戊酸雌二醇組1.12±0.07#地黃飲子湯劑高劑量組1.35±0.09#地黃飲子湯劑中劑量組1.07±0.24#地黃飲子湯劑低劑量組0.78±0.16

注：與假手術(shù)組對(duì)比，*P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，#P<0.05

2.2 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)改變對(duì)比

光鏡下顯示：假手術(shù)組大鼠的骨小梁基本結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，骨小梁排列有序、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。模型對(duì)照組大鼠的骨小梁基本結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，表現(xiàn)為骨小梁結(jié)構(gòu)不完整、斷裂和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失現(xiàn)象。地黃飲子湯劑低、中劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)有斷裂現(xiàn)象。地黃飲子湯劑高劑量組和戊酸雌二醇組骨小梁病理變化較模型對(duì)照組明顯改善，骨小梁結(jié)構(gòu)接近正常，排列比較規(guī)則有序。見(jiàn)圖 1。

1. 假手術(shù)組； 2.模型對(duì)照組； 3.戊酸雌二醇組；4. 地黃飲子湯劑高劑量組；5. 地黃飲子湯劑中劑量組；6. 地黃飲子湯劑低劑量組圖 1 各組大鼠股骨組織病理形態(tài)變化(HE，20×)

2.3 各組大鼠股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與模型對(duì)照組對(duì)比，地黃飲子湯劑各劑量組和戊酸雌二醇組股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表2和圖2。

組 別WntWnt1β-cateninLRP5假手術(shù)組0.47±0.070.63±0.050.82±0.140.75±0.04模型對(duì)照組0.98±0.04?1.17±0.07?2.34±0.11?1.83±0.09?戊酸雌二醇組0.51±0.02#0.68±0.13#1.15±0.11#0.81±0.03#地黃飲子湯劑高劑量組0.58±0.11#0.71±0.09#1.42±0.05#0.89±0.12#地黃飲子湯劑中劑量組0.62±0.04#0.75±0.02#1.52±0.13#0.95±0.05#地黃飲子湯劑低劑量組0.73±0.05#0.87±0.02#1.65±0.10#1.12±0.15#

注：與假手術(shù)組對(duì)比， *P<0.05；與模型對(duì)照組對(duì)比，# P<0.05

1.假手術(shù)組；2.模型對(duì)照組；3.戊酸雌二醇組；4.地黃飲子湯劑高劑量組； 5.地黃飲子湯劑中劑量組； 6.地黃飲子水煎劑低劑量組圖 2 各組大鼠股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白的表達(dá)

3 討 論

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)學(xué)“骨枯”“骨萎”等范疇。腎精虧虛致骨枯髓減是骨質(zhì)疏松的主要病機(jī)，故防治骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵在于補(bǔ)腎[6-7]。補(bǔ)腎中藥地黃飲子方中熟地黃、山萸肉滋補(bǔ)腎陰; 巴戟天、肉蓯蓉溫補(bǔ)腎陽(yáng)；麥冬、石斛、五味子以助滋陰斂液；附子、肉桂以助溫養(yǎng)真元，攝納浮陽(yáng)，引火歸原；菖蒲、遠(yuǎn)志、茯苓交通心腎，宣竅化痰。諸藥合用，共奏滋陰助陽(yáng)補(bǔ)腎、填精益髓之效。研究發(fā)現(xiàn)地黃飲子中的部分藥物對(duì)骨質(zhì)疏松具有治療作用[8-9]，但是諸藥合用對(duì)抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制尚未做研究。

目前，關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的病機(jī)研究主要集中于信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin信號(hào)通路和ERK1/2信號(hào)通路等[10]。Wnt、β-catenin、LRP4-6等蛋白是調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵因子[11]。Wnt與相關(guān)受體結(jié)合后在提高細(xì)胞液β-catenin含量的同時(shí)，可以促使β-catenin轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與核內(nèi)的TCF/LEF結(jié)合形成核復(fù)合物后激活下游基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[12]。研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢模型鼠可激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路[13]。Wnt1 的表達(dá)強(qiáng)度可以反映成骨細(xì)胞的骨形成活性，β-catenin和LRP5是調(diào)控成骨細(xì)胞骨量的關(guān)鍵因子[14-15]。因此，Wnt1、β-catenin和LRP5可能是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在有效靶點(diǎn)。在本研究中，HE染色結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠有骨小梁結(jié)構(gòu)不完整、斷裂和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失現(xiàn)象。說(shuō)明大鼠去卵巢后，成骨細(xì)胞活性和骨形成均受到抑制，引發(fā)骨量減少，破壞骨組織形態(tài)。使用地黃飲子干預(yù)后，高劑量組骨形成明顯活躍，骨組織形態(tài)獲得顯著改善，骨量丟失得到抑制。同時(shí)，Western-Blot結(jié)果顯示：模型對(duì)照組大鼠股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，給予地黃飲子湯劑干預(yù)后，地黃飲子湯劑各劑量組股骨組織Wnt、Wnt1、β-catenin、LRP5蛋白表達(dá)降低。說(shuō)明地黃飲子通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的上述蛋白表達(dá)來(lái)影響成骨細(xì)胞的形成、分化，抑制骨破壞，降低骨轉(zhuǎn)化率，維持骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，從而減少骨量丟失，進(jìn)而改善骨組織形態(tài)，提高骨密度，發(fā)揮對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型鼠骨量減少及骨質(zhì)疏松形成的防治作用。